實(shí)驗(yàn)原理：
將目標(biāo)抗體包被于96孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本，其中的目標(biāo)連接于固相載體上的抗體結(jié)合，然后加入微生物化的目標(biāo)抗體，將未結(jié)合的生物素抗體洗凈后，加入HRP標(biāo)記和親和素，再次徹底洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的目標(biāo)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（O.D.值），計(jì)算樣品濃度。

試劑盒組成：
試劑盒成份（2-8℃保存）    96孔配置    48孔配置    配制
96/48份酶標(biāo)板    1塊板（96T）    半塊板（48T）    即用型
塑料膜板蓋    1塊    半塊    即用型
標(biāo)準(zhǔn)品：400ng/ml    1瓶（0.6ml）    1瓶（0.3ml）    按說(shuō)明書進(jìn)行稀稀
空白對(duì)照    1瓶（1.0ml）    1瓶（0.5ml）    即用型
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液    1瓶（5ml）    1瓶（2.5ml）    即用型
生物素標(biāo)記的PⅢNT抗體    1瓶（6ml）    1瓶（3.0ml）    即用型
親和鏈酶素-HRP    1瓶（10ml）    1瓶（5.0ml）    即用型
洗滌緩沖液    1瓶（20ml）    1瓶（10ml）    按說(shuō)明書進(jìn)行稀釋
底物A    1瓶（6.0ml）    1瓶（3.0ml）    即用型
底物B    1瓶（6.0ml）    1瓶（3.0ml）    即用型
終止液    1瓶（6.0ml）    1瓶（3.0ml）    即用型

實(shí)驗(yàn)所需自備試驗(yàn)器材：
1. 酶標(biāo)儀（450nm）
2. 加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱
4. 蒸餾水或去離子水

操作注意事項(xiàng)
1．試劑應(yīng)按標(biāo)簽說(shuō)明書儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過(guò)后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。
2．實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
3．不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
4．使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時(shí)，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5．使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6．洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。
7．底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長(zhǎng)時(shí)間打開蓋子。底物B對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。
8．加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。
9．按照說(shuō)明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

試劑的準(zhǔn)備
1．  標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實(shí)驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備，不能儲(chǔ)存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行：
400ng/ml    （6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）    原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
200ng/ml    （5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）    100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
100ng/ml    （4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）    100ul的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
50ng/ml    （3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）    100ul的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
25ng/ml    （2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）    100ul的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
12.5ng/ml    （1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）    100ul的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0ng/ml    （空白對(duì)照）    原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2．  洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

操作步驟
1．使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2.根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來(lái)定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
3．加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時(shí)。
4．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
5．每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
7．每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。
8．取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。
9．在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算：
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

ELISA技術(shù)小提示：
1. 當(dāng)混合或重溶蛋白溶液時(shí)，盡量避免起沫。
2. 為了避免交叉感染，配置不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品、上樣、加不同試劑都需要換槍頭。另外不同試劑請(qǐng)分別使用不同的移液槽。
3. 每次孵育時(shí)，請(qǐng)正確使用封板膠可保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。
4. 混合后的顯色底物在上板前應(yīng)為無(wú)色，請(qǐng)避光保存；假如微孔板后，將由物色變成不同深度的藍(lán)色。
5. 終止液上板順序應(yīng)同顯色底物上板順序一致；加入終止液后，孔內(nèi)顏色由藍(lán)變黃；若孔內(nèi)有綠色，則表明孔內(nèi)液體未混勻；請(qǐng)充分混合。