一管式病毒RNA提取試劑盒說明書

產(chǎn)品編號(hào)：BTN3073

規(guī)格：50T/200T

產(chǎn)品及特點(diǎn)：

本產(chǎn)品是專用于血清(血漿)等液體樣品中提取病毒RNA的純化試劑。本產(chǎn)品回收率高,尤其適合于整合到臨床RT-PCR檢測(cè)試劑盒中。且能用于提取其他液體樣品和微量樣品。

1. 回收率達(dá)到90%以上，高于大部分基于離心柱的提取方法。

2. 靈敏度高，RT-PCR檢測(cè)到的zui終靈敏度可以達(dá)到50-100拷貝/mL(對(duì)HIV和HCV)。

3. 一管式操作，不使用離心柱，整個(gè)操作過程均在室溫下完成。

4. 環(huán)保，不需要使用苯酚和氯fang等有毒的有機(jī)溶液。

5. 可放量，如果加上病毒離心富集步驟，每管zui多可以處理樣品1.5 mL。

規(guī)格及成分：

保存條件：

常溫運(yùn)輸，4℃保存，有效期一年。

自備試劑：

異丙醇，70%乙醇。

使用方法：

一：準(zhǔn)備工作

1. 血漿的抗凝劑必須是EDTA或ACD，不能是肝素。使用ACD時(shí)由于所加入ACD會(huì)增加體積，樣品會(huì)被稀釋，得到的病毒滴度會(huì)比使用EDTA低15%左右。

2. 用于制備血漿的全血在2-25℃放置的時(shí)間不能超過6小時(shí)，在此時(shí)間內(nèi)，可以室溫800-1600g離心20分鐘，上清即為血漿。

3. 血漿可以在2-8℃或更低溫度下運(yùn)輸，可以在室溫放置一天，2-8℃放置5天，-20℃以下長期保存。

4. 血漿zui好按0.6mL/管的量分裝保存，以避免反復(fù)凍融。

5. 實(shí)驗(yàn)前所有試都必須放置在室溫。

6. 實(shí)驗(yàn)當(dāng)天新鮮配制70%的乙醇。

二：病毒提取操作

1. 標(biāo)記1.5-2 mL螺旋蓋塑料離心管(如Sarstedt CAT#:782.694.006)，為避免污染，建議不要使用壓蓋式塑料離心管。注意設(shè)置陽性和陰性對(duì)照。

2. 每管（包括正負(fù)對(duì)照管）中加入0.6 mL病毒RNAOUT溶液（需提前融化）。

3. 快速震蕩樣品幾秒，再短暫離心，取0.2 mL液體樣品加入到已經(jīng)裝有0.6 mL病毒RNAOUT溶液的管中。如果病毒需要富集，可以將1.5 mL液體樣品在4℃ 24,000 g冷凍離心60分鐘, 移棄1.3 mL上清后在取用樣品。

4. 在正負(fù)對(duì)照樣品管中分別加正負(fù)對(duì)照樣品。

5. 室溫放置10分鐘。此間可以在每個(gè)管上做個(gè)標(biāo)記，以在下步區(qū)別向心面和離心面。

6. 振蕩數(shù)秒后加入0.7 mL室溫異丙醇，旋緊蓋后振蕩30秒混勻，把離心管的向心面對(duì)向轉(zhuǎn)頭的中央，13,000-15,000 g室溫離心至少15分鐘。

7. 小心移棄上清，注意不要觸及管底和管壁離心面的RNA沉淀（此時(shí)可能看不見）。

8. 加入1.0 mL 室溫70%乙醇, 振蕩數(shù)秒后 15,000 g室溫離心5分鐘。注意：在離心機(jī)中放置離心管時(shí)將其向心面對(duì)向轉(zhuǎn)頭的中央。

9. 小心移棄上清，注意不要觸及管底和管壁離心面的RNA沉淀（此時(shí)呈膜狀沉淀）。

10. 再短暫離心數(shù)秒, 用移液器移棄殘留液體（70%乙醇），否則它會(huì)影響后續(xù)反應(yīng)。

11. 加入200 μl RNase-free水或百奧萊博的1×液相RNase Erasol(能滅活殘留的RNase, 而RNase-free水無此功能)，用移液槍仔細(xì)吹打離心管管底和管壁離心面的膜狀RNA沉淀，溶液將呈混濁狀,含少量不溶物。由于不溶沉淀物中含有RNA，所以不要離心后取上清使用，必須取混合液使用，哪怕很渾濁。

12. 直接取適量用于RT-PCR，如果溶于200 μL水,同時(shí)樣品使用量不超過RT-PCR體系的1/2，不溶物一般不會(huì)影響RT-PCR。剩余樣品可以室溫放置2小時(shí)，也可保存于-80℃保存一個(gè)月。

疑難解答：

Q：提取液體樣品/病毒核酸(RNA或DNA)為何很難？

A：原因一是量少。病毒顆粒中的RNA或DNA是作為遺傳物質(zhì)保存，每個(gè)病毒zui多只攜帶幾個(gè)拷貝(而一個(gè)細(xì)胞中有上萬個(gè)RNA分子)，同時(shí)其長度也十分有限(是細(xì)胞基因組的萬分之一以下)，樣品中病毒數(shù)往往也不是很多，使得樣品中核酸的dui量幾乎是微乎其微，十分容易丟失。另外，由于得到的核酸量少，不能使用電泳和測(cè)OD檢測(cè)，只能通過PCR或RT-PCR檢測(cè)，而病毒RNA往往具有穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步增加了鑒定的難度（即不知道是RNA提取的問題還是RT-PCR的問題）。

Q：如何判斷是病毒RNA沒提取出來還是提取出來了但沒有RT-PCR成功？

A：在RT-PCR反應(yīng)中加陽性和陰性對(duì)照。