人過(guò)氧化氫酶（CAT）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒工作原理

本試劑盒采用的是生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定樣品中人過(guò)氧化氫酶（CAT）的水平。向預(yù)先包被了人過(guò)氧化氫酶（CAT）單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入過(guò)氧化氫酶（CAT），溫育；溫育后，加入生物素標(biāo)記的抗CAT抗體，再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺與樣品中人過(guò)氧化氫酶（CAT）的濃度呈正相關(guān)。

試劑盒組成

1

標(biāo)準(zhǔn)品（800 KU/L）

0.5ml

7

顯色劑A液

6ml

2

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

3ml

8

顯色劑B液

6ml

3

酶標(biāo)包被板

12孔×8條

9

終止液

6ml

4

鏈霉親和素-HRP

6ml

10

說(shuō)明書

1份

5

30倍濃縮洗滌液

20ml

11

封板膜

2張

6

生物素標(biāo)記的抗- CAT抗體

1ml

12

密封袋

1個(gè)

需要而未提供的試劑和器材

1．   37℃恒溫箱。

2．   標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。

3．   移液器及一次性吸頭

4．   蒸餾水，

5．   一次性試管

6．   吸水紙

注意事項(xiàng)

1．   從2-8℃取出的試劑盒，在開(kāi)啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2．   各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。

3．   嚴(yán)格按照說(shuō)明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。

4．   為避免交叉污染，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和封板膜。

5．   不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

6．   底物B對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。

洗板方法

手工洗板方法：甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。

自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。

 

標(biāo)本要求

1．不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。

2．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

操作程序

1．   標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：（本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶請(qǐng)按照說(shuō)明自行在小試管中倍比稀釋）：

400KU/L

（5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）

120μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

200KU/L

（4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）

120μl的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

100KU/L

（3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）

120μl的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

50KU/L

（2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）

120μl的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

25KU/L

（1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）

120μl的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

2．   根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來(lái)定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。

3．   加樣：1）空白孔：空白對(duì)照孔不加樣品，生物素標(biāo)記的抗CAT抗體，鏈霉親和素-HRP，只加顯色劑A&B和終止液，其余各步操作相同；2）標(biāo)準(zhǔn)品孔：加入標(biāo)準(zhǔn)品50μl，鏈霉素-HRP50μl（標(biāo)準(zhǔn)品中已事先整合好生物素抗體，故不加）；3）待測(cè)樣品孔:加入樣本40μl，然后各加入抗- CAT抗體10μl、鏈酶親和素-HRP50μl，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37℃溫育60分鐘。

4．   配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

5．   洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

6．   顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘。

7．   終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

8．   測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

9.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種應(yīng)用軟件來(lái)計(jì)算。

操作程序總結(jié)：

準(zhǔn)備試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品

加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，生物素標(biāo)記二抗和酶標(biāo)試劑，37℃反應(yīng)60分鐘

洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色10分鐘

加入終止液

10分鐘之內(nèi)讀OD值

計(jì)算

檢測(cè)范圍：2KU/L→600KU/L。

規(guī)格：    96T/盒

保存：    2-8℃

有效期：  6個(gè)月（2-8℃）