乳酸脫氫酶（LDH）釋放法細胞繁殖與毒性定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

 

主要用途

 

乳酸脫氫酶（LDH）釋放法細胞繁殖與毒性定量檢測試劑是一種旨在通過酶聯(lián)連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)檢測由于細胞損傷導(dǎo)致的細胞內(nèi)穩(wěn)定的乳酸脫氫酶釋放到細胞外，使四唑鹽染料碘硝基氯化四氮唑（INT）還原為紅色甲臜（farmazan），即比色法定量測定酶活性，以評價活體細胞繁殖的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適用于各種藥物、化學(xué)、環(huán)境因子和營養(yǎng)因子處理的貼壁或懸浮生長中的動物或人體細胞。替代傳統(tǒng)的同位素[⁵¹ Cr]釋放檢測的上等選擇。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，簡捷敏感，性能穩(wěn)定，顯色清晰，檢測準確，重復(fù)性好。

 

技術(shù)背景

 

細胞凋亡或壞死而造成的細胞膜結(jié)構(gòu)的損害或完全裂解導(dǎo)致細胞漿內(nèi)的酶釋放外泄到培養(yǎng)液里，其中包括活性穩(wěn)定的乳酸脫氫酶。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）釋放法的測定是基于在乳酸脫氫酶的作用下，還原NAD⁺反應(yīng)生成的NADH，再與氧化型2-（4-碘苯）-3-（4-硝基苯）-5-苯四唑（Iodonitrotetrazolium；INT）在硫辛酰胺脫氫酶（diaphorase）的催化下反應(yīng)生成紅色生色產(chǎn)物甲臜（formazan），在490nm波長下產(chǎn)生吸收峰，從而確定釋放的乳酸脫氫酶的活性，作為細胞膜完整性的標志：吸光值與細胞死亡或毒性程度成線性正相關(guān)。酶聯(lián)連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)為：

lactate dehydrogenase

NAD⁺  +  Lactate   →    Pyruvate  +  NADH

diaphorase

NADH  +  INT        →   NAD⁺  +   Formazan（red）

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

裂解液（Reagent A）      1毫升

補充液（Reagent B） 1毫升

反應(yīng)液（Reagent C）      5毫升

顯色液（Reagent D）      1毫升

終止液（Reagent E）      1毫升

標準液（Reagent F）     20微升

產(chǎn)品說明書                         1份

 

保存方式

 

保存在－20℃冰箱里，反應(yīng)液（Reagent C）和顯色液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

 

 

用戶自備

 

96孔細胞培養(yǎng)板：用于細胞操作的容器

細胞培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)

孔板離心機：用于沉淀細胞

酶標儀：用于定量檢測染色后的細胞

 

實驗步驟

 

一、 貼壁細胞檢測

 

1． 準備96孔細胞培養(yǎng)板的待測細胞（每孔100微升）：包括未處理的對照細胞（樣品對照孔），未處理的后續(xù)裂解的細胞（樣品zui大酶活性對照孔），以及藥物處理的細胞（處理樣品孔），并做好標記（細胞密度為每孔2 X 10³至2 X 10⁴細胞）

2． 到規(guī)定的檢測時間點前1小時，從濕潤的細胞培養(yǎng)箱里取出待測的96孔細胞培養(yǎng)板（注意：確保細胞培養(yǎng)液維持在100微升容量）

3． 加入10微升裂解液（Reagent A）到未處理的后續(xù)裂解的細胞孔里（樣品zui大酶活性對照孔）

4． 同時加入10微升補充液（Reagent B）到其余所有檢測孔里

5． 放回濕潤的細胞培養(yǎng)箱里，繼續(xù)培養(yǎng)1小時，即規(guī)定檢測時間

6． 從濕潤的細胞培養(yǎng)箱里取出待測的96孔細胞培養(yǎng)板

7． 放進孔板離心機離心10分鐘，速度為250g

8． 分別小心移取50微升上清液到新的96孔板的相應(yīng)孔里，避免觸摸細胞顆粒，同時注意做好標記

9． 分別加入50微升反應(yīng)液（Reagent C）（注意：使用前，須混勻）

10． 分別加入10微升顯色液（Reagent D） 

11． 搖動96孔板混勻

12． 在室溫下孵育30分鐘，避免光照

13． （選擇步驟）分別加入10微升終止液（Reagent E）

14． 即刻放進酶標儀里測讀：波長490nm

15． 計算處理樣品實際吸光讀數(shù)：處理樣品孔吸光讀數(shù)－樣品對照孔吸光讀數(shù)

16． 計算樣品細胞zui大酶活性的實際吸光讀數(shù)：樣品zui大酶活性對照孔吸光讀數(shù)－樣品對照孔吸光讀數(shù)

17． 計算細胞毒性或死亡率（％）：

 

（處理樣品實際吸光讀數(shù)÷樣品細胞zui大酶活性的實際吸光讀數(shù)）X 100

 

18． 或繪制細胞生長曲線：縱座標（Y軸）為實際吸光讀數(shù)（A）；橫坐標（X軸）為細胞數(shù)或時間點或藥物濃度；據(jù)此計算其LD₅₀

 

二、 懸浮細胞檢測

 

1． 準備96孔細胞培養(yǎng)板的待測懸浮細胞（每孔100微升）：包括未處理的對照細胞（樣品對照孔），未處理的后續(xù)裂解的細胞（樣品zui大酶活性對照孔），以及藥物處理的細胞（處理樣品孔），并做好標記（細胞密度為每孔5 X 10³至5 X 10⁴細胞）

2． 到規(guī)定的檢測時間點前1小時，從濕潤的細胞培養(yǎng)箱里取出待測的96孔細胞培養(yǎng)板（注意：確保細胞培養(yǎng)液維持在100微升容量）

3． 加入10微升裂解液（Reagent A）到未處理的后續(xù)裂解的細胞孔里（樣品zui大酶活性對照孔）

4． 同時加入10微升補充液（Reagent B）到其余所有檢測孔里

5． 放回濕潤的細胞培養(yǎng)箱里，繼續(xù)培養(yǎng)1小時，即規(guī)定檢測時間

6． 從濕潤的細胞培養(yǎng)箱里取出待測的96孔細胞培養(yǎng)板

7． 放進孔板離心機離心10分鐘，速度為250g

8． 分別小心移取50微升上清液到新的96孔板的相應(yīng)孔里，避免觸摸細胞顆粒，同時注意做好標記

9． 分別加入50微升反應(yīng)液（Reagent C）（注意：使用前，須混勻）

10． 分別加入10微升顯色液（Reagent D） 

11． 搖動96孔板混勻

12． 在30℃溫度下孵育30分鐘，避免光照

13． （選擇步驟）分別加入10微升終止液（Reagent E）

14． 即刻放進酶標儀里測讀：波長490nm

15． 計算處理樣品實際吸光讀數(shù)：處理樣品孔吸光讀數(shù)－樣品對照孔吸光讀數(shù)

16． 計算樣品細胞zui大酶活性的實際吸光讀數(shù)：樣品zui大酶活性對照孔吸光讀數(shù)－樣品對照孔吸光讀數(shù)）

17． 計算細胞毒性或死亡率（％）：

 

（處理樣品實際吸光讀數(shù)÷樣品細胞zui大酶活性的實際吸光讀數(shù)）X 100

 

18． 或繪制細胞生長曲線：縱座標（Y軸）為實際吸光讀數(shù)（A）；橫坐標（X軸）為細胞數(shù)或時間點或藥物濃度；據(jù)此計算其LD₅₀

 

注意事項

 

1． 本產(chǎn)品為100次（1個96孔板）操作

2． 操作時須戴手套

3． 整個操作須無菌操作

4． 建議每個樣品安排3個孔，即重復(fù)3次，計算時取其平均值

5． 檢測體系相應(yīng)增加，試劑用量按比例相應(yīng)增加：例如200微升檢測體系，試劑用量增加1倍

6． 每孔中的培養(yǎng)液需100微升，避免使用周邊培養(yǎng)孔（常常液體蒸發(fā)而減少）

7． 系統(tǒng)測試，可以加入2至5微升標準液（Reagent G）到50微升無細胞的細胞培養(yǎng)液里，然后按照說明書加入反應(yīng)液（Reagent C）和顯色液（Reagent D）即可

8． 細胞裂解效果不佳，可以使用20微升裂解液（Reagent A）處理

9． 孵育時，須避光

10． 染色完成后，建議即刻檢測，zui遲不得超過1小時

11． 細胞培養(yǎng)和處理時，避免使用草酸（OXALATE），草氨酸（OXAMATE）和EDTA，否則影響檢測的準確性

12． 血清含有乳酸脫氫酶，建議使用濃度不要超過1％

13． 細胞過度生長、密度過高、離心速度過大、培養(yǎng)箱內(nèi)外溫差過大等因素會造成細胞自然釋放乳酸脫氫酶

14． 酚紅會干擾檢測

15． 樣品zui大酶活性對照孔或zui大OD吸光讀數(shù)與細胞裂解程度密切相關(guān)

16． 如果用戶沒有孔板離心機，則移取上清液時格外小心

17． 如果用戶沒有匹配的波長，可以使用波長470nm至570nm之間的任一波長替代

18． 本公司提供系列細胞繁殖檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標準

 

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

 

使用承諾

 

杰美基因秉著“信譽至上、客戶滿意、質(zhì)量承諾”的宗旨為我們的用戶提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說明書上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴格的質(zhì)量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問題，請立即以書面形式（實驗報告）與本公司咨詢，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。

 

友情提醒

 

IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

 

訂購信息

 

單組分訂購信息

 

編號 名稱 規(guī)格

GMS10073 乳酸脫氫酶釋放法細胞繁殖與毒性定量檢測試劑盒 100次

GMS10073A  裂解液（Reagent A） 50毫升

GMS10073B  補充液（Reagent B） 50毫升

GMS10073C  反應(yīng)液（Reagent C） 50毫升

GMS10073D  顯色液（Reagent D） 10毫升

GMS10073E  終止液（Reagent E） 10毫升

GMS10073F  標準液（Reagent F） 100微升

 

試劑盒訂購信息

 

產(chǎn)品編號	產(chǎn)品名稱	規(guī)格
GMS10007	結(jié)晶紫細胞群落染色試劑盒	250次
GMS10008	細胞活力藍色熒光檢測試劑盒	50次
GMS10009	細胞活力臺盼藍染色試劑盒	100次
GMS10029	中性紅細胞繁殖比色法定量檢測試劑盒	500次
GMS10039	MTT比色法細胞繁殖測定試劑盒	500次
GMS10043	MTS細胞繁殖定量檢測試劑盒	500次
GMS10044	綠色熒光細胞繁殖定量檢測試劑盒	500次
GMS10045	PICOGREEN細胞繁殖定量檢測試劑盒	50次
GMS10046	G-B細胞活力和凋亡檢測試劑盒	50次
GMS10051	ATP生物發(fā)光法細胞繁殖與毒性定量檢測試劑盒	50次
GMS10052	R-G細胞活力和凋亡檢測試劑盒	100次
GMS10033	BrdU標記法細胞繁殖流式細胞儀檢測試劑盒	10次
GMS10034	BrdU標記法細胞繁殖顯微鏡檢測試劑盒	10次
GMS10073	乳酸脫氫酶（LDH）釋放法細胞繁殖與毒性定量檢測試劑盒	100次
GMS10083	酸性磷酸酶（AP）活力法細胞繁殖與毒性定量檢測試劑盒	100次
GMS10084	葡萄糖耗損法細胞繁殖與毒性定量檢測試劑盒	500次
GMS10085	紅色熒光細胞繁殖與毒性定量檢測試劑盒	500次
GMS10086	磺酰羅丹明B（Sulforhodamine B）細胞繁殖與毒性定量檢測試劑盒	500次
GMS10087	考馬斯亮藍細胞繁殖與毒性定量檢測試劑盒	500次
GMS10036	XTT比色法細胞繁殖測定試劑盒	500次