Collagen II IHC Assay
產(chǎn)品編號(hào)：KFS023
儲(chǔ)存條件：2-8℃ 保存，有效期 6 個(gè)月
For Research Use Only
一、試劑盒說明
本試劑盒可用于免疫組織化學(xué)方法以顯示人、大、小鼠來源的組織樣本Collagen II抗原分布。
本試劑盒適用于常規(guī)福爾馬林固定石蠟包埋切片、冰凍切片、培養(yǎng)固定的細(xì)胞涂片等。即用型一步法免疫組化檢測(cè)試劑盒與常規(guī)免疫組化染色試劑盒相比，具有高靈敏性、高特異性及操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。多個(gè)HRP聚合物直接與二抗相連，大大放大了抗原抗體結(jié)合的信號(hào)，減少了孵育步驟，孵育時(shí)間縮短為10分鐘。試劑盒不含有生物素，完全避免了內(nèi)源性生物素造成的背景影響。試劑盒提供的DAB顯色試劑為增強(qiáng)型顯色試劑，且自帶稀釋液，避免了由于水質(zhì)的不同對(duì)DAB顯色造成的影響；與一般DAB試劑相比，增強(qiáng)型的穩(wěn)定性顯著提高，顯色更醒目，敏感性更高。
二、試劑盒組份
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組份 |
KFS023（50 tests） |
儲(chǔ)存條件 |
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Collagen II 兔多抗 |
50 μl |
2-8℃/-20℃ |
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增強(qiáng)劑 |
3 ml |
2-8℃ |
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HRP 聚合物 (即用型) |
3 ml |
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試劑 A：20×DAB 底物緩沖液 A |
160 μl |
2-8℃，避光 |
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試劑 B：20×DAB 底物緩沖液 B |
160 μl |
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試劑 C：20×DAB 底物緩沖液 C |
160 μl |
備注：抗體在 2-8℃可以保存 6 個(gè)月，長期保存可以分裝保存于-20℃。
三、試劑盒以外自備試劑和儀器
二甲苯、乙醇、蒸餾水或去離子水、3%H2O2-甲醇、10%山羊血清封閉液、10 mM PBS（pH 7.4）、免疫組化筆、蘇木素染液、封片膠、顯微鏡。
四、使用注意事項(xiàng)
1. 檢測(cè)標(biāo)本時(shí)需同時(shí)做陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。
2. 增強(qiáng)劑中含有 0.1% ProClin 300 防腐劑，使用時(shí)請(qǐng)注意自我防護(hù)。
3. DAB 顯色液需現(xiàn)用現(xiàn)配，避光放置，且在 2 小時(shí)內(nèi)染色。
4. 在超過有效期的試劑盒中一種或多種試劑的活性可能降低，因此不得使用過期的試劑盒，不同批號(hào)間試劑盒也不能交叉混用。
五、推薦操作方法（以石蠟切片為例）
1. 石蠟切片二甲苯脫蠟、梯度酒精水化，用PBS(pH7.4)沖洗三次，每次3分鐘（3x3min）。
（注意：從此步驟起，嚴(yán)禁標(biāo)本或組織切片干燥）。
2. 抗原修復(fù)（選做步驟：石蠟組織切片建議進(jìn)行蛋白酶K修復(fù)20ug/ml，37℃，30min）。
3. 如有必要，每張切片加50μl雙氧水-甲醇封閉液（需完全覆蓋組織），室溫下孵育5分鐘，以
阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS洗滌3×2min。
4. 除去PBS液，每片加50~100μl的10%山羊血清封閉液（自備），濕盒內(nèi)室溫或37度孵育30分鐘。PBS洗滌3×2min。
5. 除去PBS液，每張切片加50~100μl的collagen II兔多抗(用戶根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行自選，用量
體積按完全覆蓋組織為準(zhǔn)，建議抗體稀釋比例為：固定細(xì)胞1:100-500；冰凍切片1:100-500；石蠟切片1:50-200)，濕盒內(nèi)室溫（或37度）孵育60分鐘或4℃過夜。PBS洗滌3×2min。
6. 除去PBS液，每張切片加50μl增強(qiáng)劑（需完全覆蓋組織），室溫下（或37度濕盒）孵育30
分鐘。PBS洗滌3× 2min。
7. 除去PBS液，每片加50μl HRP聚合物（需完全覆蓋組織），室溫下（或37度濕盒）孵育
30分鐘。PBS洗滌3× 2min。
8. 制備DAB顯色液（需現(xiàn)用現(xiàn)配；可根據(jù)需要一次染多張切片），以染十張切片為例：取25μl試劑A加入到425μl超純水中，再加入25μl試劑B和25μl試劑C，混勻。（避光放置，2小時(shí)內(nèi)使用）
9. 除去PBS液，每張切片加50μl~100μl新鮮配制的DAB顯色液（需完全覆蓋組織），室溫下
孵育5分鐘，顯微鏡下觀察控制顯色時(shí)間。
10. 自來水沖洗2min；蘇木素復(fù)染；如有必要，可用0.1%HCl分化，自來水沖洗，PBS返藍(lán)。
11. 切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。
六、結(jié)果： 陽性結(jié)果為在抗原定位處染棕黃或棕褐色。
七、可能出現(xiàn)的問題及解決辦法
1. 脫蠟不徹底，容易出現(xiàn)非特異性背景染色，建議免疫組化切片脫蠟與常規(guī)HE脫蠟分開。
2. 操作過程中沖洗不充分，容易出現(xiàn)非特異性背景染色，需嚴(yán)格控制沖洗時(shí)間與次數(shù)。
3. 為防止可能出現(xiàn)的假陽性、假陰性結(jié)果，建議在實(shí)驗(yàn)過程設(shè)置陽性與陰性對(duì)照。
4. 操作中滴加試劑時(shí)緩沖液PBS未瀝干致使試劑稀釋，將引起染色強(qiáng)度變?nèi)趸蚣訇幮园l(fā)生。因此，每步滴加試劑前應(yīng)將組織片上的PBS液除干，但又必須預(yù)防干片。
