細(xì)菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細(xì)胞質(zhì)中、du立于細(xì)胞染色體之外的復(fù)制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過(guò)細(xì)胞分裂傳遞到后代。

 

    質(zhì)粒已成為目前zui常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質(zhì)粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質(zhì)粒DNA的提取，本實(shí)驗(yàn)采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。

 

    堿裂解法是一種應(yīng)用zui為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，其基本原理為：當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速?gòu)?fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時(shí)留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時(shí)可沉淀下來(lái)。

 

    純化質(zhì)粒DNA的方法通常是利用了質(zhì)粒DNA相對(duì)較小及共價(jià)閉環(huán)兩個(gè)性質(zhì)。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、聚乙二醇分級(jí)沉淀等方法，但這些方法相對(duì)昂貴或費(fèi)時(shí)。對(duì)于小量制備的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過(guò)苯酚、lv仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡(jiǎn)單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA，所得純化的質(zhì)粒DNA已可滿足細(xì)菌轉(zhuǎn)化、DNA,PIAN段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標(biāo)記等要求，故在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常用。

 

 

    一、試劑準(zhǔn)備

 

    1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高壓滅菌15min ，貯存于4℃。

 

    2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時(shí)配置。

 

    3. 溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存?zhèn)溆谩?/span>

 

    4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>

 

    5.苯酚/lv仿/異戊醇（25：24：1）

 

    6.乙醇（無(wú)水乙醇、70%乙醇）

 

    7. 5×TBE：Tris 堿54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>

 

    8．溴化乙錠（EB）：10mg/ml

 

    9.RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝后貯存于-20℃。

 

    10. 6×loading buffer（上樣緩沖液）：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。

 

    11. 1% 瓊脂糖凝膠：稱取1g瓊脂糖于三角燒瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5靏/ml（注意：EB為強(qiáng)誘變劑，操作時(shí)帶手套），輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液0.5×TBE），即可上樣。

 

    二、操作步驟

 

    1. 挑取LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落，接種于2.0ml LB（含相應(yīng)抗生素）液體培養(yǎng)基中，37℃、250g振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（約12-14hr）。

 

    2.取1.5ml培養(yǎng)物入微量離心管中，室溫離心8000g×1min，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。

 

    3.將細(xì)菌沉淀重懸于100靗預(yù)冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。

 

    4.加200靗新鮮配制的溶液Ⅱ，顛倒數(shù)次混勻（不要?jiǎng)×艺袷帲?，并將離心管放置于冰上2-3min，使細(xì)胞膜裂解（溶液Ⅱ?yàn)榱呀庖?，故離心管中菌液逐漸變清）。

 

    5.加入150靗預(yù)冷的溶液Ⅲ，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ為中和溶液，此時(shí)質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時(shí)K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀。

 

    6.加入450靗的苯酚/lv仿/異戊醇，振蕩混勻，4℃離心12000g × 10min。

 

    7.小心移出上清于一新微量離心管中，加入2.5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻，室溫放置2-5min，4℃離心12000g×15min。

 

    8.1ml預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀1-2次，4℃離心8000g×7min，棄上清，將沉淀在室溫下晾干。

 

    9.沉淀溶于20靗 TE（含RNase A 20靏/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

 

    三、質(zhì)粒DNA的電泳檢測(cè)

 

    觀察瓊脂凝膠中DNA的zui簡(jiǎn)單方法是利用熒光染料溴化乙錠進(jìn)行染色。該物質(zhì)含有一個(gè)可以嵌入DNA的堆積堿基之間的一個(gè)平面基團(tuán)，這個(gè)基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致染料與DNA結(jié)合并呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離染料溶液有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身則在302nm和366nm有光吸收。這兩種情況下，被吸收的能量可在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來(lái)。因此，當(dāng)凝膠中含有游離溴化乙錠時(shí)即可以檢測(cè)到少量的DNA。

 

    取制備的質(zhì)粒DNA 1-2靗，加適當(dāng)loading buffer混勻上樣,采用 1-5V/cm的電壓，使DNA分子從負(fù)向正移動(dòng)至合適位置，取出凝膠置紫外燈下檢測(cè)，攝片。

 

    四、注意事項(xiàng)

 

    本裂解法小量制備質(zhì)粒 DNA重復(fù)性好，一般無(wú)麻煩。若所提取質(zhì)粒 DNA不能被限制性內(nèi)切酶切割，可通過(guò)酚/lv仿再次抽提，以清除雜質(zhì)來(lái)解決問(wèn)題。