北京百奧萊博供應(yīng)的包涵體大量純化試劑盒用于科學(xué)研究，本產(chǎn)品質(zhì)量好，且具價格，深為用戶稱道，了解更多包涵體大量純化試劑盒等蛋白質(zhì)研究產(chǎn)品請聯(lián)系我司咨詢訂購。...

特別提示：包括包涵體大量純化試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：包涵體大量純化試劑盒
英文名稱：Inclusion Body Maxiprep Kit
產(chǎn)品貨號：BTN90510
產(chǎn)品規(guī)格：2次

本產(chǎn)品是包涵體微量純化試劑盒的大提升級產(chǎn)品，用于大量，快速的提取高質(zhì)量的包涵體。

產(chǎn)品特點：
1.大量提取，1次可處理多達(dá)5升的菌液，相當(dāng)于50次中量提取。
2.適合制備級別的包涵體純化，需在50mL以上的離心管或離心瓶中完成。
3. 能有效去除包涵體中的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜等非重組蛋白成份，使重組蛋白在包涵體中所占比重達(dá)到60%以上。
4. 即可以選擇高壓裂解法，也可以采用酶學(xué)裂解法裂解細(xì)菌。
5. 得到的包涵體可以用于重折疊，也可以用于凝膠層析和動物免疫。

試劑盒組成：

成分	規(guī)格
溶液A	100mL
溶液B	250mL×2
包涵體溶解液	100ml
溶菌酶	100mg
說明書	1份

儲存條件：常溫運輸，4℃保存(溶菌酶需要-20℃保存，包涵體溶解液可以室溫保存)，有效期一年。

自備試劑：如果得到的重組蛋白確有降解則需要自備蛋白酶抑制劑混合物(BTN80808)。

使用方法：

一．細(xì)胞沉淀：
1．轉(zhuǎn)移1-5升菌液到干凈的、預(yù)稱重量的塑料離心瓶中。如果離心瓶體積不夠大，可以分多次反復(fù)離心收集。
2．5000g(相當(dāng)于Sorvall GSA轉(zhuǎn)頭5500rpm)4℃離心15-30分鐘，小心棄上清。
3．復(fù)稱重量，差值就是細(xì)菌的濕重。1升的過夜培養(yǎng)的大腸桿菌濕重一般為3克，所以1-5升菌液一般能得到3-15克細(xì)菌。注意：后續(xù)操作的很多溶液都是按此步得到得細(xì)胞濕重添加。
4．細(xì)胞沉淀可以立即使用或存放在-80℃待用。

二．細(xì)胞裂解(下面兩法中選其一)：
 高壓破碎法(French Press)+超聲法(推薦方法)
1．按每克細(xì)菌濕重加入3mL溶液A重懸細(xì)胞，可以用玻璃棒攪拌或用Waring搗碎機勻漿(如果細(xì)菌濕重超過10克)使細(xì)菌懸浮，直到檢測不到成塊的細(xì)胞為止。如有必要，可以加入溶菌酶干粉，使其終濃度為0.2mg/mL。
2．讓細(xì)胞通過壓力為16000-18000 lb/in2的高壓細(xì)胞破碎儀，收集的細(xì)胞裂解液需放冰上。
3．重復(fù)上步操作一次或多次，直到大部分細(xì)菌都被裂解。注意：每次處理后zuì好在顯微鏡下檢查細(xì)菌裂解的比例。
4．將細(xì)胞裂解液置于冰浴中，用超聲破碎儀滿功率下超聲處理5分鐘，工作狀態(tài)為50%(開0.5秒，關(guān)0.5秒)。此過程中zuì好將細(xì)胞裂解液放冰上并用磁力攪拌器攪拌，否則產(chǎn)生的熱量會使包涵體蛋白變性，在純化中丟失。
 酶法+超聲法(在沒有高壓破碎儀器時選方法)
1．按每克細(xì)菌濕重加入3mL的含溶菌酶的溶液A重懸細(xì)胞，可以用玻璃棒攪拌細(xì)菌沉淀使之懸浮。
2．在細(xì)菌懸浮液中加入溶菌酶干粉，使其終濃度為0.2mg/mL，攪拌混勻后37℃放置30分鐘裂解細(xì)菌，其間不時需要用玻璃棒混勻。細(xì)菌釋放出的DNA將使裂解物變得十分粘稠。如果不粘稠，說明裂解不充分，需要繼續(xù)裂解，否則完整細(xì)菌將和包涵體一起沉淀，影響包涵體的純度。由于處理量大，zuì好在顯微鏡下檢查細(xì)菌是否充分裂解。
3．將細(xì)胞裂解液置于冰浴中，用超聲破碎儀滿功率下超聲處理5分鐘，工作狀態(tài)為50%(開0.5秒，關(guān)0.5秒)。此過程中zuì好將細(xì)胞裂解液放冰上并用磁力攪拌器攪拌，否則產(chǎn)生的熱量會使包涵體蛋白變性，在純化中丟失。

三．包涵體純化：
1．將超聲處理的細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到離心瓶中，22000g 4℃下高速離心60分鐘(注意：轉(zhuǎn)子不同其對應(yīng)的離心速度不同)，小心收集上清。上清含有以可溶形式存在的重組蛋白，可以保留作為SDS-PAGE對照樣品。
2. 將沉淀(主要由包涵體構(gòu)成)懸浮在預(yù)冷的溶液B中。每克細(xì)菌需要5mL溶液B，1升細(xì)菌的濕重約3克，大約需要15mL溶液B，用玻璃棒或勻漿器攪拌混勻后室溫放置5分鐘。
3．22000g 4℃下高速離心30分鐘，沉淀將出現(xiàn)三層，zuì下面的是未徹底破裂的細(xì)胞碎片，其上是包涵體，zuì上層的松軟沉淀是細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜。如果處理過程中使用過溶菌酶，則此層較薄。小心收集上清，可以作為包涵體次洗滌的對照樣品。
4．重復(fù)第8-第9步直到上清變清和zuì上層細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜松軟沉淀消失，此過程一般需要重復(fù)洗滌2次(共3次洗滌)，小心收集上清作為包涵體第二次洗滌和第三次洗滌的對照樣品。本試劑盒提供的溶液B足夠一次5升規(guī)模的提取洗3次，如需更多溶液B請單獨購買。
5．上步得到的沉淀即為包涵體，其中重組蛋白一般占60%重量，其余40%為其他蛋白質(zhì)。此沉淀可以長期放置在-80℃冰箱待用，也可以直接用于免疫動物制備抗體，還可以直接進(jìn)入下面得包涵體的溶解步驟。
6．估計重組蛋白的產(chǎn)率：先需要通過預(yù)實驗知道重組蛋白的表達(dá)水品，如果表達(dá)水平為1%，則1克濕重的細(xì)菌中將含有1mg重組蛋白質(zhì)。此法得到的重組蛋白質(zhì)的回收率一般在75%，即1mg重組蛋白質(zhì)能得到0.75mg，丟失0.25mg。

四．包涵體的溶解：
1．在室溫下，將包涵體溶解液加入到包涵體沉淀中，用槍頭充分吹打后漩渦震蕩。如果需要將溶解的包涵體直接用于凝膠過濾層析進(jìn)一步純化，則按每克原始細(xì)胞濕重加入1mL包涵體溶解液，重組蛋白的濃度約為4-5mg/mL；如果需要將溶解的包涵體直接用于蛋白質(zhì)折疊，則按每克原始細(xì)胞濕重加入3mL包涵體溶解液，重組蛋白的濃度約為1-2mg/mL；注意：包涵體溶解液低溫放置會產(chǎn)生沉淀，必須45-65℃溶化并混勻后才能使用。
2．室溫放置1小時使蛋白質(zhì)充分溶解。
3．100,000g 4℃離心60分鐘(轉(zhuǎn)速需要根據(jù)離心機轉(zhuǎn)子的大小換算)，小心收集上清，保留不溶性沉淀。注意：檢查離心管能否承受此離心力。SDS-PAGE檢查是否大部分重組蛋白都在上清中。如果沒有，說明包涵體沒有完全溶解，需要用適當(dāng)增加包涵體溶解液的用量。
4．將上清(溶解的包涵體)分成10-20mL一份，放于塑料離心管中(不要超過離心管容量的70%)置-80℃長期保存或直接用于復(fù)性等試驗。由于不同的蛋白質(zhì)有不同的zuì佳復(fù)性條件，需要用戶自己摸索。包涵體純化過程中引入了溶菌酶，在SDS-PAGE分析時可能有額外條帶出現(xiàn)。

根據(jù)您的關(guān)注的包涵體大量純化試劑盒，您可能還對以下產(chǎn)品有需求：



名稱：牛血清γ球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(2mg/mL)
貨號：BTN131071
規(guī)格：1mL
牛血清γ球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(BGG)經(jīng)過濾除菌，質(zhì)量穩(wěn)定。本產(chǎn)品是考馬斯(Bradford)分析實驗的理想標(biāo)準(zhǔn)品，是使用任何方法測定抗體濃度的理想標(biāo)準(zhǔn)品。本產(chǎn)品濃度為2mg/mL。本品僅用于科研實驗，不能用作醫(yī)療及臨床診斷。

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑：0.9% NaCl溶液或PBS緩沖液、BCA工作液。

使用方法：
本產(chǎn)品可應(yīng)用于蛋白分析定量(BCA蛋白分析、考馬斯-Bradford分析等)、抗體脫鹽回收或其他層析操作的對照、SDS-PAGE電泳和分光光度計紫外燈的常規(guī)校準(zhǔn)(吸收峰在280nm)等實驗。由于蛋白操作彼此差別太大，本手冊只列出此產(chǎn)品用于BCA蛋白分析的實驗流程，其他流程不在此詳述。

1．標(biāo)準(zhǔn)品溶液的稀釋方法見下表。此標(biāo)準(zhǔn)品溶液的稀釋可使用去離子水、0.9% NaCl或PBS。

2mg/mL本品(μL)	稀釋液(μL)	稀釋后產(chǎn)品終濃度(μg/mL)
120	0	2000
90	30	1500
60	60	1000
45	75	750
30	90	500
15	105	250
10	110	125
0	120	0(空白對照)

2．本產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
1)分別取50μL稀釋后的本標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入到1.5mL離心管中，每個濃度取2個平行樣。
2)在每管中各加入1mL工作液后，立即混勻。
3)37℃水浴槽中反應(yīng)30分鐘后，冷卻至室溫。
4)使用分光光度計測定562nm處的吸光度值。測定時，使用1mL比色皿，用水校零。盡可能在20分鐘內(nèi)檢測完畢所有樣品。
5)各濃度本標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度值減去空白對照的平均值，繪制本標(biāo)準(zhǔn)品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3．檢測樣品的測定
 檢測樣品建議與本標(biāo)準(zhǔn)品溶液同時進(jìn)行測定，測定方法同上，與本標(biāo)準(zhǔn)品的測定方法一致。如果必要也可選擇與本標(biāo)準(zhǔn)品溶液相同的稀釋方法稀釋檢測樣品后測定。


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ALH381	加熱型考馬斯亮蘭快速染色液	500ml|2000ml
RFT064	30％丙稀酰胺溶液(19:1)	100ml
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KFS225	細(xì)胞色素C蛋白檢測試劑盒	50T

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