超級(jí)雜交液(不含甲酰胺)是高品質(zhì)的探針標(biāo)記及檢測(cè)產(chǎn)品，由北京百奧萊博供應(yīng)，本產(chǎn)品用于科學(xué)研究，本品質(zhì)量穩(wěn)定，價(jià)位合理，需要超級(jí)雜交液(不含甲酰胺)等探針標(biāo)記及檢測(cè)產(chǎn)品的客戶，請(qǐng)到我公司官網(wǎng)聯(lián)系我們。...

特別提示：包括超級(jí)雜交液(不含甲酰胺)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：超級(jí)雜交液(不含甲酰胺)
英文名稱：Super hybrid solution(formamide free)
產(chǎn)品貨號(hào)：BTN8091
產(chǎn)品規(guī)格：100mL

核酸雜交一般是指用一種標(biāo)記的核酸探針與印跡膜上的核酸進(jìn)行雜交，由此檢測(cè)印跡膜上是否存在與探針同源的核酸分子(靶分子)。核酸雜交是分子生物學(xué)的基本技術(shù)之一，應(yīng)用非常廣泛。由于核酸雜交效率受印跡膜種類、雜交溫度、探針濃度、雜交液離子強(qiáng)度、雜交液pH及雜交液粘度等因素影響，用戶自己摸索和優(yōu)化相關(guān)條件非常繁瑣，因此本公司開發(fā)了本產(chǎn)品，其操作流程如下：


產(chǎn)品特點(diǎn)：
1. 既可用于Southern雜交(靶分子為DNA)，也可用于和Northern雜交(靶分子為RNA)，還可以用于菌落雜交，基因芯片等雜交。
2. 既可以用于同位素探針的雜交，也可以用于非同位素探針的雜交。
3. 既可以使用DNA(包括DNA Oligo)探針，也可以使用RNA探針(包括RNA Oligo)
4.含多種能夠促進(jìn)雜交的聚合物，使雜交反應(yīng)能在6～12小時(shí)完成，而常規(guī)雜交反應(yīng)一般需要12～24小時(shí)。
5.含多種封堵劑，能阻印跡膜對(duì)探針?lè)肿拥姆翘禺愋晕?，能有效降低背景信?hào)，延長(zhǎng)曝光時(shí)間以便檢測(cè)到低拷貝的RNA(Northern)和單拷貝的基因(Southern)。
6. A型不含甲酰胺，B型含50%的甲酰胺。后者使雜交在較低溫度就可以完成，適合Tm 較高的分子雜交(如RNA-RNA和RNA-DNA雜交)。
7.跟各種常用的印跡膜兼容，包括硝酸纖維素膜和尼龍膜。

儲(chǔ)存條件：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。本產(chǎn)品屬于高鹽溶液，低溫下產(chǎn)生沉淀，必須在65℃加熱溶解并充分搖勻后才能使用。

使用方法：

一、根據(jù)探針和靶分子的不同，分別按下面不同情況計(jì)算雜交分子的Tm 值
1. 對(duì)DNA-DNA雜交，其Tm = 81.5 + 16.6×log10[Na+] + 0.41×GC%–500/L
說(shuō)明：L是探針或靶分子的長(zhǎng)度(用兩者中zuì短的一個(gè))
GC%是探針或靶分子中的GC 百分比(用兩者中zuì短的一個(gè))
Na+濃度是本產(chǎn)品中Na+的濃度，為0.75 M，16.6 ×log10[Na+]=(-2.07)
2. 對(duì)DNA-RNA雜交，其Tm 值比DNA-DNA的Tm 值要高10-15℃。
3. 對(duì)RNA-RNA雜交，其Tm 值比DNA-DNA的Tm 值要高20-25℃。
4. 對(duì)Oligo探針雜交，Tm=GC 數(shù)量×4℃+AT 數(shù)量×2℃。

二、確定zuì佳雜交溫度(預(yù)雜交溫度跟雜交溫度應(yīng)該一樣)
1. 對(duì)于大于200bp的DNA-DNA雜交，zuì佳雜交溫度一般比Tm低15-25℃，一般選擇68℃。
2. 對(duì)RNA-RNA或DNA-RNA雜交，zuì佳雜交溫度一般比Tm低15-25℃。如果這樣計(jì)算出的雜交溫度很高(如高于70℃)，則RNA容易降解，所以zuì好選用含甲酰胺的超級(jí)雜交液(B型本產(chǎn)品)，以便能在42℃完成雜交。
3. 對(duì)Oligo探針的雜交，zuì佳雜交溫度一般比Tm低5℃。由于Oligo較短，更容易受各種因素影響(如錯(cuò)配率、修飾堿基比例等)，所以zuì佳溫度需要適度摸索和優(yōu)化。

三、確定洗膜溫度
一般使用0.1×SSC做洗膜液，在此條件下的zuì佳洗膜溫度比Tm低5-12℃，一般情況下可以在55℃進(jìn)行洗膜。Oligo探針可以室溫洗膜。

四、預(yù)雜交步驟
預(yù)雜交就是用不含探針的本產(chǎn)品跟印跡膜進(jìn)行孵育，其目的是用所含的非特異性DNA分子(鮭精DNA或小牛胸腺DNA)及其它高分子化合物將印跡膜上會(huì)非特異地吸附探針?lè)肿拥奈稽c(diǎn)封閉，否則這些位點(diǎn)會(huì)吸附標(biāo)記的探針，造成高背景。
1. 將結(jié)合了靶分子的硝酸纖維素印跡膜或尼龍印跡膜浸泡于自備的6×SSC溶液中，使其充分濕潤(rùn)。
2. 將濕潤(rùn)的印跡膜置于一塑料雜交袋中(塑料袋zuì好預(yù)先封口，再剪掉一角，留一個(gè)小口)，按每平方厘米印跡膜加0.2mL超級(jí)雜交液的比例沿小口加入超級(jí)雜交液，然后用塑料封口機(jī)將口封牢。
3. 將此塑料袋浸沒(méi)入溫度設(shè)定在zuì佳雜交溫度的恒溫水浴中或雜交爐中，保溫1-2小時(shí)，延長(zhǎng)到12-16小時(shí)亦可。注意保溫過(guò)程中塑料袋應(yīng)在不停的搖動(dòng)狀態(tài)中，使超級(jí)雜交液與印跡膜充分接觸。

五、雜交步驟
1. 如果標(biāo)記的探針是雙鏈核酸，則需經(jīng)變性處理。具體操作是將探針樣品在沸水浴中加熱5分鐘，然后迅速置冰浴中。如果是單鏈DNA或RNA探針，則不需變性，直接使用。
2. 將單鏈探針或變性后的雙鏈探針加入到完成了預(yù)雜交的雜交袋中(先用剪刀剪一小口，加入探針后用熱封機(jī)封口)。探針的加入量視探針標(biāo)記效率而定，一般要求終濃度不能低于1-2 ng/mL。如果檢測(cè)基因組中的單拷貝基因，探針的加入量應(yīng)加大，而對(duì)于檢測(cè)克隆的基因片段，則探針的量可減少。如果是放射性探針，應(yīng)將此塑料袋套在另一塑料袋之中，以避免雜交袋發(fā)生遺漏、污染工作環(huán)境。
3.在選定的雜交溫度下繼續(xù)保溫，時(shí)間一般為6-12小時(shí)。

六、洗膜步驟。注意在下面的所有操作過(guò)程中，一定不要使印跡膜干燥。
此步是將與印跡膜非特異結(jié)合的探針?lè)肿酉慈ザ涣粝绿禺惤Y(jié)合的探針?lè)肿印Ｓ捎诜翘禺愋噪s交的雜交分子解鏈溫度較低，熱穩(wěn)定性較差，在一定的溫度和較低的離子強(qiáng)度下，即可洗掉。
1.雜交完畢，取出塑料袋，剪去一角，倒出所有的含探針的雜交液。此含探針的雜交液可以多次使用再倒棄。
2. 剪開雜交袋，用鑷子取出印跡膜，浸沒(méi)于大量的2×SSC(含0.5%SDS)溶液中，室溫下振蕩漂洗15分鐘。
3. 重復(fù)上步操作一次。
4. 將印跡膜轉(zhuǎn)移至0.1×SSC(含0.1% SDS)溶液中，在計(jì)算好的洗膜溫度下振蕩漂洗30分鐘至1小時(shí)。
5. 重復(fù)上步操作一次。如果是同位素標(biāo)記探針，則需要重復(fù)至用蓋革計(jì)數(shù)器在無(wú)核酸區(qū)域檢測(cè)不出放射信號(hào)為止。
6. 將印跡膜轉(zhuǎn)移到濾紙上，吸去表面液體后印跡膜即可用于后續(xù)檢測(cè)。

疑難解答：
問(wèn)題一：高背景(有或沒(méi)有雜交信號(hào))
解決方案：將放射性探針的比活降低到2×10E6 cpm/mL以下；將非放射性探針的終濃度降低到30 ng/mL以下；將探針長(zhǎng)度控制在200–800 核苷酸；減少雜交時(shí)間；適當(dāng)提高雜交溫度。
問(wèn)題二：沒(méi)有雜交信號(hào)或雜交信號(hào)非常弱
解決方案：雜交過(guò)程中應(yīng)應(yīng)該連續(xù)振蕩，不應(yīng)該有氣泡，避免印跡膜變干。將放射性探針活性提高到>5×10E8 cpm/ng，提高非放射性標(biāo)記探針的終濃度；適當(dāng)降低雜交溫度。

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YT358 細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光探針(Fura-2 AM) 50微升

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名稱：PCR法DNA探針dì高辛標(biāo)記試劑盒
貨號(hào)：BTN90604C
規(guī)格：5次
PCR標(biāo)記的原理是用帶標(biāo)記的dNTP進(jìn)行PCR，zuì后得到的PCR產(chǎn)物將帶有標(biāo)記，可以直接用于雜交試驗(yàn)。其原理示意圖如下：


產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.一站式，本試劑盒提供經(jīng)過(guò)優(yōu)化的試劑，不需要用戶自己摸索。
2. 足夠10次50μl體系的常規(guī)PCR(用于制備標(biāo)記反應(yīng)的模板和設(shè)置對(duì)照反應(yīng))和5次50μl體系的標(biāo)記反應(yīng)。
3.一次標(biāo)記可以得到μg級(jí)的雙鏈DNA探針或約700ng的單鏈DNA探針，足夠多次雜交實(shí)驗(yàn)用。
4. 既可用于制備雙鏈探針，也可以用于單鏈探針。
5. 90604A需自備含標(biāo)記核苷酸的dNTP，90604B和90604C分別含生物素和dì高辛標(biāo)記的底物。自備的標(biāo)記包括fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP和aminoallyl-dUTP等。
6. 本產(chǎn)品得到的探針參入率一般為4-5%(每100個(gè)核苷酸中有4-5個(gè)將帶有非同位素標(biāo)記)，有效降低了空間阻礙，檢測(cè)效果zuì佳。
7.可以用于Southern和Northern Blot、原位雜交、菌落和斑點(diǎn)印跡雜交等分析。

試劑盒組成：

成分	規(guī)格
2×標(biāo)記專用PCR Mix	500μl
dNTP，2mM each	50μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP	25μL(僅B有)
含DIG-11-dUTP的dNTP	25μL(僅C有)
超純水	1ml
說(shuō)明書	1份

注：標(biāo)記專用PCR Mix不含dNTP。

儲(chǔ)存條件：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一：準(zhǔn)備工作
1. 按常規(guī)的方法設(shè)計(jì)PCR引物，使探針長(zhǎng)度在400-800bp之間。過(guò)短則標(biāo)記參入少，探針雜交信號(hào)強(qiáng)度減弱；過(guò)長(zhǎng)則非特異雜交增加，背景變強(qiáng)。
2. 根據(jù)PCR引物優(yōu)化PCR條件。
3. 由于標(biāo)記的dNTP比較珍貴，所以本試劑盒不推薦以基因組DNA或其他復(fù)雜DNA為模板直接進(jìn)行PCR標(biāo)記，而是建議采取下述的兩步法標(biāo)記來(lái)提高成功率，即先制備非標(biāo)記PCR產(chǎn)物，再以之為模板制備標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。
二：非標(biāo)記PCR產(chǎn)物的制備
4. 設(shè)置50μL PCR的反應(yīng)體系：

成份	用量
2×標(biāo)記專用PCR Mix	25μl
dNTP，2mM each	5μl
自備的探針引物一(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自備的探針引物二(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自備的模板DNA	1μg基因組DNA或1ng質(zhì)粒DNA
超純水	補(bǔ)到50μL

5. 按已經(jīng)優(yōu)化的PCR參數(shù)進(jìn)行PCR。
6.電泳檢測(cè)和膠回收所需的PCR產(chǎn)物，并定量。用10 pmol引物一般能得到1μg左右的PCR產(chǎn)物(具體取決于PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度)。注意：zuì好采取膠回收而不是PCR回收以避免殘留引物干擾后續(xù)的標(biāo)記PCR。
三：標(biāo)記PCR反應(yīng)(zuì好做一個(gè)不加標(biāo)記的對(duì)照用于定量)
說(shuō)明：在設(shè)置下面反應(yīng)時(shí)，如果加一種引物，就得到單鏈標(biāo)記的PCR產(chǎn)物；如果加兩種引物，則得到雙鏈標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。由于雙鏈PCR探針在雜交前雖然要變性成單鏈后使用，但雜交時(shí)變性的雙鏈彼此還會(huì)復(fù)性，這種復(fù)性會(huì)與探針-靶DNA雜交反應(yīng)相競(jìng)爭(zhēng)，降低雜交效率，因此強(qiáng)烈推薦使用單鏈標(biāo)記的DNA探針。

成份	樣品	對(duì)照
2×標(biāo)記專用PCR Mix	25μl	25μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP或 含DIG-11-dUTP的dNTP或 自備的含其他標(biāo)記dUTP的dNTP	5μl	不加
dNTP，2mM	不加	5μl
雙鏈標(biāo)記：探針引物一和引物二 單鏈標(biāo)記：探針引物一或引物二	每種50 pmol 一種50 pmol	每種50 pmol 一種50 pmol
上步膠純化所得PCR產(chǎn)物 (單鏈標(biāo)記可用100ng)	10 ng	10 ng
超純水	補(bǔ)到50μL	補(bǔ)到50μL

 注意：本試劑盒提供的dNTP混合物中，標(biāo)記底物與非標(biāo)記底物的比例已經(jīng)進(jìn)過(guò)優(yōu)化，如果自備標(biāo)記dUTP，其與dTTP的zuì佳比例需要優(yōu)化，標(biāo)記不同，比例不同。對(duì)DIG-11-dUTP，zuì佳比例1：3；對(duì)BrdUTP，zuì佳比例為1：1。
7. 按第5步的PCR參數(shù)進(jìn)行標(biāo)記PCR，但需要進(jìn)行下列修改：一是循環(huán)數(shù)增加到35-55個(gè)循環(huán)。由于模板為純化后的PCR產(chǎn)物，探針對(duì)擴(kuò)增長(zhǎng)度完整性要求不高(長(zhǎng)度不均的探針由于能形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，效果反而更好)，所以可以增加循環(huán)數(shù)；二是延伸時(shí)間增加15秒，因?yàn)闃?biāo)記dUTP參入到DNA的速度比常規(guī)的dTTP慢；三是降低復(fù)性溫度5-7℃，因?yàn)闃?biāo)記核苷酸參入到DNA后，新模板的Tm值將降低。
8. 標(biāo)記探針的定量：取標(biāo)記反應(yīng)和對(duì)照反應(yīng)的產(chǎn)物1-5μl，在瓊脂糖凝膠上跟濃度已知的DNA marker一起電泳，并判斷探針的濃度。由于標(biāo)記反應(yīng)的PCR產(chǎn)物中額外帶有非同位素的配體(生物素，dì高辛等)、因此其泳動(dòng)速度將慢于非標(biāo)記PCR產(chǎn)物(但同位素標(biāo)記不能用此法)。
 注意：如果擴(kuò)增的是單鏈DNA探針，其結(jié)合EB的能力遠(yuǎn)低于雙鏈DNA(EB是嵌合到雙鏈堿基對(duì)之間的，而單鏈DNA沒(méi)有堿基對(duì)，只有一些局部區(qū)域折疊形成的有限雙鏈區(qū)，因此能結(jié)合的EB很少)，因此EB染色的強(qiáng)弱不能準(zhǔn)確反應(yīng)DNA的濃度，可以采用銀染定量(跟marker比較)。一般100ng模板按上述條件經(jīng)過(guò)單鏈PCR擴(kuò)增可得到700ng左右探針。
9. 剩余的PCR標(biāo)記產(chǎn)物可以不經(jīng)過(guò)純化，直接加入(對(duì)單鏈PCR探針)雜或加熱變性并急冷后加入(對(duì)雙鏈PCR探針)到雜交液中使用。如果暫時(shí)不用請(qǐng)放-20℃長(zhǎng)期保存。如果需要純化，請(qǐng)使用乙酸銨/乙醇沉淀法。

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