本試劑盒中不含有EDTA，與金屬螯和層析等下游應(yīng)用兼容。本試劑盒提取的蛋白含高濃度鹽成分，不可直接用于2D電泳，如下游實(shí)驗(yàn)需要直接用于等電聚焦、雙向電泳，請(qǐng)使用其他貨號(hào)試劑盒。也可將最后樣品除鹽后再用于2D電泳，可用蛋白脫鹽柱脫鹽處理(HR0389)。...

細(xì)胞核膜蛋白提取試劑盒

 

產(chǎn)品編號(hào)：HR0149

細(xì)胞核膜蛋白提取試劑盒試劑盒組成：

儲(chǔ)存條件：

提取液、溶解液2～8℃保存，蛋白酶抑制劑-20℃保存。有效期1年。

【注】：

● 蛋白酶抑制劑未開(kāi)蓋使用前也可以2-8℃保存，開(kāi)蓋使用后-20℃保存。

● 蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時(shí)是固體狀態(tài),從冰箱取出后恢復(fù)至室溫或37℃短時(shí)間水浴,變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開(kāi)蓋。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

核膜蛋白提取試劑盒提供全套試劑，適用于從各種原代或傳代細(xì)胞和各種實(shí)體組織(如腦、脊髓、神經(jīng)結(jié)或纖維、脂肪、肝臟、消化道、腎臟、心臟、肌肉、血管、結(jié)締組織等動(dòng)物組織)中提取細(xì)胞核的膜蛋白。

本試劑盒含有的獨(dú)特配方能有效溶解細(xì)胞核膜組份，本試劑盒含有的蛋白酶抑制劑混合物能有效阻止蛋白酶對(duì)蛋白的降解，以保障提取高純度的蛋白。

本試劑盒提取的蛋白為具有天然構(gòu)象的活性蛋白，可用于Western Blotting、蛋白電泳、免疫沉淀、ELISA、轉(zhuǎn)錄活性分析、Gel shift凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、、酶活性測(cè)定等下游蛋白研究實(shí)驗(yàn)。

本試劑盒中不含有EDTA，與金屬螯和層析等下游應(yīng)用兼容。

本試劑盒提取的蛋白含高濃度鹽成分，不可直接用于2D電泳，如下游實(shí)驗(yàn)需要直接用于等電聚焦、雙向電泳，請(qǐng)使用其他貨號(hào)試劑盒。也可將最后樣品除鹽后再用于2D電泳，可用蛋白脫鹽柱脫鹽處理(HR0389)。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

● 使用方便，從細(xì)胞中提取蛋白不需經(jīng)過(guò)研磨、反復(fù)凍融、超聲破碎等前處理。

● 將蛋白提取的時(shí)間縮短至1小時(shí)。

● 含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。

● 紫外檢測(cè)蛋白濃度時(shí)，背景干擾低。

● 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 移液器 ● 離心機(jī) ● 振蕩器 ● 勻漿機(jī)/勻漿器 ● 渦旋混勻器 ● PBS

● 蛋白定量試劑盒

細(xì)胞核膜蛋白提取試劑盒注意事項(xiàng)：

● 旋帽離心管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。

● 實(shí)驗(yàn)中的所有試劑須預(yù)冷，所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷，整個(gè)過(guò)程須保持樣品處于低溫。

● 蛋白酶抑制劑儲(chǔ)存期間溶液如果出現(xiàn)沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。

● 可以根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。

● 提取液B在使用前需一直置于2-8℃，否則下游膜蛋白提取時(shí)會(huì)導(dǎo)致不容易分層。

● 膜蛋白電泳時(shí)Loading Buffer應(yīng)該避免煮沸。

● 膜蛋白電泳時(shí)可以提高Loading Buffer的SDS含量。

使用方法：

1、提取準(zhǔn)備：

每500μL冷的提取液A和B中分別加入2μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

【注】：

● 根據(jù)需處理的樣品量準(zhǔn)備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次性全部加入提取液。

● 加過(guò)蛋白酶抑制劑的提取液一周內(nèi)未用完，再次用前需重新加入蛋白酶抑制劑。

2、取5～10×10⁶個(gè)細(xì)胞，在4℃，500×g條件離心2～3分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集細(xì)胞。

【注】：

● 由于核膜蛋白含量較少，需要較多的細(xì)胞才能保證得率，因此在條件允許的條件下，盡可能加大細(xì)胞量。

3、用冷PBS 洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。

4、細(xì)胞沉淀中加入400μL冷的提取液A，高速渦旋振蕩15秒，置2-8℃條件振蕩15～30分鐘。

【注】：

● 提取液A處理后細(xì)胞體積應(yīng)減小，否則延長(zhǎng)提取液A振蕩處理時(shí)間。

● 使用振蕩器或搖床的較低轉(zhuǎn)速，保持提取液可輕微晃動(dòng)即可。

● 沒(méi)有振蕩條件也可不振蕩，稍微延長(zhǎng)提取液處理時(shí)間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻。

5、在4℃，10000×g條件下離心5分鐘。棄上清，留沉淀。

6、在沉淀中加入300～500μL冷的提取液B，高速渦旋振蕩15秒，充分混勻。

【注】：

● 每次的裂解液用量并不是一定的，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。

● 由于核膜蛋白含量較少，需要較多的細(xì)胞才能保證得率，因此在條件允許的條件下，盡可能加大細(xì)胞量。

● 提取液B在使用前需一直置于2-8℃，否則下游膜蛋白提取時(shí)會(huì)導(dǎo)致不容易分層。

7、置2～8℃條件下振蕩20～30分鐘。

【注】：

● 此步驟必須在2～8條件下振蕩。

● 使用振蕩器或搖床的較低轉(zhuǎn)速，保持提取液可輕微晃動(dòng)即可。

● 無(wú)振蕩條件也可不振蕩，置2～8℃靜置，稍微延長(zhǎng)提取液處理時(shí)間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻。

8、在4℃，12000×g條件下離心5分鐘。

9、將上清吸入另一干凈的離心管，在37℃水浴10分鐘。

10、在37℃，1000×g離心5分鐘。此時(shí)溶液分為兩層，下層是核膜蛋白約為30～50μL。

【注】：

● 此步驟必須在37℃條件下離心。

● 沒(méi)有37℃離心條件的也可以不離心，稍微延長(zhǎng)37℃水浴時(shí)間，至液體澄清，分層清晰。

11、此時(shí)溶液分為兩層，小心吸掉上層，留著備用分析，分離出管底部下層大約30～50μL液體。

【注】：

● 下層為核膜蛋白。

● 下層為粘稠狀液體。

● 待下游目的核膜蛋白試驗(yàn)完成后再丟棄上層部分。核膜蛋白萃取不完全時(shí)此上次部分蛋白仍可以進(jìn)行再次提取核膜蛋白。

12、用50～200μL冷的溶解液C稀釋該下層核膜蛋白部分，即得細(xì)胞核膜蛋白樣品。

【注】：

● 膜蛋白比較難溶解，不能很快溶解混勻，可以在加入溶解液后稍微吹打混勻，然后置于4℃冰箱靜置溶解。中途用移液器輕輕吹打混勻一次，靜置后取出再次用移液器稍微吹打混勻即可。

● 靜置直至管底透明膠狀物完全溶解。

13、將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌?shí)驗(yàn)。

【注】：

● 建議用BCA法進(jìn)行蛋白定量。

● 蛋白樣品-80℃存放一年沒(méi)有問(wèn)題，注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細(xì)菌污染。

常見(jiàn)問(wèn)題分析：

● 蛋白濃度低？

膜蛋白豐度比較低,在條件允許的情況下,需要盡可能加大細(xì)胞的上樣量以提高膜蛋白濃度。

處理部分組織樣本時(shí)可能沒(méi)有裂解完全,導(dǎo)致蛋白濃度低。只要適當(dāng)延長(zhǎng)試劑A的處理時(shí)間即可。最好在持續(xù)振蕩的條件下處理,沒(méi)有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。

● 用什么方法定量蛋白？

建議用BCA法。不適合用Bradford法,因?yàn)樵噭〢中含有干擾Bradford法的組份,導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。如果已經(jīng)進(jìn)行過(guò)透析處理或者用脫鹽柱改換過(guò)緩沖體系,則可以用Bradford法定量。

● 提取的蛋白具有活性嗎？

本試劑盒不含有離子型去垢劑組份,不破壞蛋白的結(jié)構(gòu),沒(méi)有對(duì)蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞,蛋白均保持其天然構(gòu)象和活性。

● 膜蛋白電泳沒(méi)有條帶？

膜蛋白樣品通常濃度較低，電泳前一定要進(jìn)行蛋白定量，以保證電泳是蛋白上樣量足夠。膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可超聲處理一下，再進(jìn)行蛋白定量。

蛋白加Loading Buffer后可以不用煮沸，采用50℃保溫30分鐘。

蛋白Loading Buffer中SDS終濃度含量可以提高至3%-10%。

有些樣品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上樣緩沖液中，一般可以跑出清晰的蛋白條帶。

電泳時(shí)最好采用低電壓低電流電
泳。

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