總RNA提取試劑由專業(yè)試劑供應商北京百奧萊博提供，用于科研目的，我公司的總RNA提取試劑品質(zhì)上佳，經(jīng)過多年的開發(fā)生產(chǎn)，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶訂購。...

特別提示：包括總RNA提取試劑在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：總RNA提取試劑
英文名稱：Total RNA Extraction Reagent
產(chǎn)品貨號：WH0065
產(chǎn)品規(guī)格：100ml

本制品是基于異硫氰酸胍/苯酚法的一種即用的從細胞和組織中提取總RNA的試劑，在樣品裂解或勻漿過程中，本制品可保持RNA完整性，同時裂解細胞，溶解細胞內(nèi)含物。加入氯fǎng后，溶液分為水相、中間層和有機相，RNA在水相中。取出水相，用異丙醇可沉淀回收RNA；中間層用乙醇沉淀可回收DNA；有機相用異丙醇沉淀可回收蛋白。本制品可用于小量樣品（50-100mg組織、5×1067
產(chǎn)品特點：
·本制品為黃顏色，便于區(qū)分水相和有機相，方便使用。
· RNA純度高：可有效去除DNA殘留、有機溶劑污染和蛋白雜質(zhì)。
· RNA得率高，可用于多種下游實驗。

儲存條件：2-8℃避光保存12個月。

自備試劑：氯fǎng、異丙醇、RNase-free ddH2O、75%乙醇（用RNase-free ddH2O配制）。

預防RNase污染，應注意以下幾方面：
1．經(jīng)常更換新手套。因為皮膚經(jīng)常帶有細菌，可能導致RNase污染。
2．使用無RNase的塑料制品和槍頭避免交叉污染。
3．RNA在裂解液RL中時不會被RNase降解。但提取后繼續(xù)處理過程中應使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。
4．配制溶液應使用無RNase的水。（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.1%（V/V)，放置過夜，高壓滅菌。）

使用前注意事項：
1．勻漿后，加氯fǎng前，樣品可在-70℃放置一個月以上；
2．RNA沉淀可以保存在75%酒精中，2-8℃一個星期以上或-20℃一年。

操作步驟：
1．勻漿處理
a．植物組織：以葉片RNA提取為例。取新鮮葉片在液氮中充分研磨或?qū)⑷~片剪碎后直接在本制品中研磨，研磨要迅速，zuì好不要超過1 min。大約100mg葉片使用1ml本制品。
b．動物組織：以鼠肝臟RNA提取為例。取新鮮或-70℃凍存組織，每30-50 mg組織加入1ml本制品，用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積一般不要超過本制品體積的10%。
c．單層培養(yǎng)細胞：單層貼壁細胞的收集（收集細胞數(shù)量請不要超過1×107   1)直接裂解法：直接在培養(yǎng)板中加入本制品裂解細胞，每10cm2面積加入1ml本制品。用取樣器吹打幾次。注意：本制品加量根據(jù)培養(yǎng)板面積決定，不是由細胞數(shù)決定。如果本制品加量不足，可能導致提取的RNA中有DNA污染。
  2)胰蛋白酶處理法：確定細胞數(shù)量，吸除培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞，吸除PBS，向細胞中加入含有0.1-0.25%胰蛋白酶的PBS處理細胞，當細胞脫離容器壁時，加入含有血清的培養(yǎng)基失活胰蛋白酶，將細胞溶液轉(zhuǎn)移至RNase-Free的離心管中，300×g離心5 min，收集細胞沉淀，仔細吸除所有上清。
  注意：收集細胞時一定要將細胞培養(yǎng)液去除干凈，否則會導致裂解不完全，造成RNA的產(chǎn)量降低。
d．細胞懸液：離心取細胞。每5×10⁶-10⁷動物、植物和酵母細胞或每10⁷細菌細胞加入1ml本制品。加入本制品前不要洗滌細胞，以免降解mRNA。一些酵母和細菌細胞可能需要勻漿儀處理。
e．血液處理：直接取新鮮的血液，加入3倍體積本制品（推薦0.25 ml全血加入0.75 ml本制品），充分振蕩混勻。
2．將勻漿樣品在15-30℃放置5 min，使得核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：4℃ 12000rpm（~13400×g)離心10min，取上清。
  注意：如果樣品中含有較多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物結節(jié)部分等，可離心去除。離心得到的沉淀中包括細胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織樣品時，上層是大量油脂，應除去。取澄清的勻漿溶液進行下一步操作。
4．每使用1ml本制品加入0.2 ml氯fǎng，蓋好管蓋，劇烈振蕩15 sec，室溫放置3 min。
  注意：如不能旋渦混勻，可手動顛倒混勻2 min代替。
5．4℃ 12000rpm（~13400×g)離心10-15 min，樣品會分成三層：黃色的有機相，中間層和上層無色的水相，RNA主要在水相中，把水相（約600μl）轉(zhuǎn)移到新的離心管中。（如要分離DNA和蛋白質(zhì)，可向我公司索取提取方法)。
6．在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置20-30 min。
7．4℃ 12000rpm（~13400×g)離心10min，去上清。離心前RNA沉淀經(jīng)常是看不見的，離心后在管側和管底形成膠狀沉淀。
8．加入1ml 75%乙醇（RNase-Free ddH2O配置)洗滌沉淀。每使用1ml本制品至少用1ml75%乙醇對沉淀進行洗滌。
9．4℃ 5000rpm（~2,300×g)離心3 min。倒出液體，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液體短暫離心，然后用槍頭吸出，注意不要吸到沉淀。
10．室溫放置晾干（不要晾的過干，RNA完全干燥后會很難溶解，大約晾干2-3 min左右即可），根據(jù)實驗需要，加入30-100 μl RNase-Free ddH2O，反復吹打、混勻，充分溶解RNA。

不同組織或細胞RNA提取預期得率：
植物葉片：100～200μg/g葉片
動物組織：6～10μg/mg肝臟組織
動植物培養(yǎng)細胞：5～10μg/10⁶細胞
大腸桿菌：2～10μg/ml DH5α過夜菌
血液：3～5μg/ml人類全血

常見問題分析：

低得率：
A．樣品裂解或勻漿處理不徹底。
B．zuì后得到的RNA沉淀未完全溶解。

A260/A280<1.65：
A．檢測吸光度時，RNA樣品不是溶于TE，而是溶于水。低離子濃度和低pH條件下，A280值會較高。
B．樣品勻漿時加的試劑量太少。
C．勻漿后樣品未在室溫放置5 min。
D．水相中混有有機相。
E．zuì后得到的RNA沉淀未完全溶解。

RNA降解：
A．組織取出后沒有馬上處理或冷凍。
B．樣品或提取的RNA沉淀保存于-5℃- -20℃，未在-60℃- -70℃保存。
C．細胞在胰蛋白酶處理時被破壞。
D．溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理。
E．電泳時使用的甲酰胺pH低于3.5。

DNA污染：
A．樣品勻漿時加的試劑體積太少。
B．樣品中含有組織溶劑（如乙醇，DMSO等)，強緩沖液或堿性溶液。

蛋白和多糖污染：
A．樣品中蛋白、多糖含量高。
B．樣品量太大。
C．水相中混有有機相。

根據(jù)您的關注的總RNA提取試劑，您可能還對以下產(chǎn)品有需求：



名稱：細菌RNA提取試劑盒
貨號：BTN51102
規(guī)格：100次
本試劑盒是在動物RNA提取試劑盒基礎上根據(jù)細菌提取的具體情況改良而得。它基于異硫氰酸胍/酚/氯fǎng提取RNA原理，可用于包括E.coli、Campylobacter fetus、Pseudomonas aeruginosa、Rhodobacter sphaeroides等各種常見的革氏陰性細菌。如果需要提革氏陽性細菌(如Bacillus subtilis、Staphylococcus aureus等)的RNA，可以選擇真菌RNA提取試劑盒。

試劑盒特點：
1. 操作簡單快速，只要十分鐘左右,可以全在室溫下進行。
2. 所得 RNA 質(zhì)量高,OD260/OD280一般在 1.9，不含基因 DNA污染。
3. 靈敏度高，可以從一個菌落中提取到普通電泳能夠檢測到的總 RNA。
4. 高于進口同類產(chǎn)品。

試劑盒組成：

成分	規(guī)格
細菌RNA提取試劑	100ml
說明書	1份

儲存條件：常溫運輸，4℃保存，有效期一年。

使用方法：
1.在 1.5mL塑料離心管中離心收集0.2-1.5mL 新鮮細菌(注意:由于細菌RNA 半衰期十分短，所以，必須使用zuì新鮮細菌)，吸盡液體培養(yǎng)基，加入1mL細菌RNA提取試劑盒并用槍充分吹打，確保細菌全部裂解，沒有塊狀物。
 如果使用菌落，則用接種環(huán)小心將其轉(zhuǎn)移到裝有1mL細菌RNA提取試劑盒的1.5 m塑料離心管中，用移液槍吹打均勻。在細菌數(shù)較少時，建議使 用助沉劑 RNApp以提高 RNA 回收率。
2. 加入0.2mL 氯fǎng，在振蕩器上充分振蕩混均 30秒(必須將管底的液體振蕩起來，否則不能有效將DNA 打斷和去除蛋白質(zhì))。
3. 12000～15000g室溫離心3分鐘。上清液無色，下層液呈籃色，中間為蛋白質(zhì)。小心將上清液轉(zhuǎn)移到另一干凈 1.5ml塑料離心管中，上清液體積約為0.6mL。為避免觸及中間層的DNA和蛋白質(zhì)，建議分小量多次 吸取，并且只取 0.5mL，留 0.1mL左右。當細菌數(shù)量較少時，中間層十分松散，上清時很容易吸到下層有機相，需要更加小心。
4.在上清液中加入等體積的異丙醇，振蕩器上振蕩混均 30秒。
5. 12000～15000室溫離心 3-10分鐘，RNA 將在管底側面形成沉淀。
6.小心吸棄上清液，注意不要吸棄 RNA沉淀。
7.在離心管中加入1mL 75%乙醇，振蕩器上振蕩混均 30秒。
8. 12000～15000g室溫離心 1分鐘。
9.小心吸棄上清液，注意不要吸棄 RNA沉淀。
10. 重復第 8 到第 10 步一次。
11. 短暫快速離心，用移液槍小心吸棄殘留液(約50μl)。
12. 短暫放 1-2分鐘后加入適量 RNA 溶解液使 RNA沉淀溶解，可以立即使用或存放于-80℃長期保存。
13. RNA 完整性的電泳檢測：
 如果需要做 Northern雜交，強烈建議用戶使用甲醛變性膠進行RNA電泳，因為非變性膠不能分離所有的RNA分子(BioTechniques，28：414，2000)。如果是簡單檢測，可以使用TAE或百奧萊博的SuperBuffer-2 DNA/RNA 兩用快速電泳液，但文獻報道必須使用變性上樣液(BioTechniques，9：558，1990)。普通 DNA上樣液不含變性劑，也沒經(jīng)過去 RNase處理，所以zuì好不要使用。 尤其需要注意的是不要使用TBE進行RNA電泳，因為TBE 所含硼酸是研究多糖的經(jīng)典方法----硼酸絡合法中的關鍵成分，硼酸通過與RNA 核糖中的羥基發(fā)生絡合反應，形成RNA分子內(nèi)或RNA分子間的絡合復合物，使同樣長度的RNA 具有不同的泳動速度，電泳條帶彌散，同時有大的RNA 絡合復合物遲留在加樣孔中(一般會誤以為是基因組DNA污染)。RNA分子內(nèi)或RNA分子間的絡合物的形成的多少和比例又與硼酸與RNA的數(shù)量比例有關，而RNA樣品中污染的其他多糖(如植物中提取的RNA)也會參與此反應，使硼酸對RNA電泳的影響更復雜，所以TBE 對RNA電泳的影響沒有規(guī)律性和重復性。有的樣品可以使用有的又不行，zuì好是避免使用。
 由于細菌細胞中70-80%的RNA為rRNA，后者又由23S(約3700nt)，16S(約1700nt)和5S(約100nt)三種組成，所以變性膠電泳后應該在UV下看見三條清晰的rRNA帶。由于核酸長度與結合 EB的數(shù)量成正比(當然還與RNA的二級結構有關，雙鏈部分結合能力比單鏈部分強)，所以23S rRNA條帶的熒光強度一般比16S rRNA條帶的熒光強度強2倍。如果這兩條rRNA 帶不清晰或比例小于此范圍則表示 RNA 有降解(因為大的RNA 被酶降解的可能更大)。
14. RNA產(chǎn)量產(chǎn)率測定：
 將5-10μl RNA 溶于TE緩沖液中(pH7.5-8.2 之間)檢測其在OD260的光吸收。通過光吸收可以得出 RNA濃度(1 OD260的RNA=40μg/mL)，進而計算出 RNA的產(chǎn)量和產(chǎn)率。注意不要將RNA 稀釋在 DEPC 水中檢測 OD260和OD280，否則光吸收比在 TE中測得的低 10%-15%，因為核酸光吸收跟溶液 pH相關，而 DEPC 水中的DEPC高壓分解后產(chǎn)生的CO2與水反應生成碳酸，使溶液 pH降低進而降低 RNA的光吸收。
15. RNA 純度測定：
 無污染的總 RNA的OD260/OD280一般在 1.8-2.1 之間(具體數(shù)值與其堿基組成和溶液成分等多種因素有關)，OD260/OD230一般在2.0-2.3 之間，如果低于或高于此范圍則分別表示樣品可能有蛋白質(zhì)或多糖的污染，但一般不影響 RT-PCR等反應。蛋白質(zhì)污染可以通過酚/氯fǎng抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA和多糖污染可以分別用百奧萊博的DNAScavenger和PS Scavenger去除。

疑難解答：
Q：上樣孔里的紅色熒光物一定是污染的基因組DNA嗎？
A：不是。用 TAE或TBE電泳液和非變性膠電泳 RNA時容易產(chǎn)生此現(xiàn)象，百奧萊博初步研究發(fā)現(xiàn)大部分紅色熒光物是變性不充分的單鏈RNA 通過堿基互補或通過硼酸絡合(如果使用TBE作電泳液的話)形成的復合物，加 RNase處理后，這些紅色熒光物一般會消失。為避免此現(xiàn)象，建議zuì好使用甲醛變性膠電泳。如果需要使用非變性膠，也必須在上樣前使RNA變性。使用百奧萊博優(yōu)化的上樣/變性/染色三用溶液 RNAload可以使 RNA在非變性膠上電泳時也有較好分辨率。使用非變性膠時，可以使用TAE或超快電泳液SuperBuffer-2，zuì好不要使用TBE緩沖液，因為TBE中的硼酸能與RNA的多羥基形成復合物，RNA 很難形成銳利的條帶。
Q：如何確認和去處除污染的基因組 DNA？
A：如果懷疑有 DNA污染，可以用 RNase處理 RNA樣品，然后再電泳。如果上樣孔里的紅色熒光物不消失，則表示是基因組 DNA污染。進一步確認可以使用 PCR擴增法。去除污染的DNA可以使用非酶的DNA 去除劑DNA Scavenger或RNase-free DNase，由于RNase-free DNase一般都有殘留的RNase污染，所以必須嚴格按照廠家提供的使用說明書進行操作。

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