一步法cDNA鏈合成試劑盒由北京百奧萊博供貨并提供相關(guān)技術(shù)服務(wù)支持，本品僅用于生物化學(xué)研究方面，本產(chǎn)品質(zhì)量好，且具價格，深為用戶稱道，了解更多一步法cDNA鏈合成試劑盒等基因結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)品請聯(lián)系我司咨詢訂購。...

特別提示：包括一步法cDNA鏈合成試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：一步法cDNA鏈合成試劑盒
英文名稱：First cDNA Synthesis Kit（with gDNA Remover）
產(chǎn)品貨號：MT0015
產(chǎn)品規(guī)格：20μl×100次|20μl×2000次

本試劑盒采用穩(wěn)定的反轉(zhuǎn)錄預(yù)混體系5×RT MasterMix進行RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使用時只需加入模板、引物和RNase Free H2O即可，大大簡化了操作過程、提高了效率、減少了操作過程中的人為誤差。MasterMix中添加了dsDNase（熱敏雙鏈特異性核酸酶），該雙鏈特異性核酸酶（又名gDNA Remover）可在反轉(zhuǎn)錄的過程中，直接降解去除RNA中殘留的基因組DNA污染(可去除100ng基因組DNA)，從而在定量PCR的檢測中無需考慮基因組污染的干擾，設(shè)計的定量PCR引物也無需進行橫跨外顯子。該試劑盒尤其適用于定量PCR檢測。

該預(yù)混體系包含點突變致RNase H活性缺失的反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、反應(yīng)Buffer、gDNA去除試劑和RNase抑制劑。該試劑盒采用的反轉(zhuǎn)錄酶去除了RNase H活性，從而避免反轉(zhuǎn)錄過程中降解RNA。同時經(jīng)過突變文庫篩選，使得其熱穩(wěn)定性更強，可耐受55℃高溫反應(yīng)。相比于低溫條件下反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用高溫反轉(zhuǎn)錄可顯著打開RNA二級結(jié)構(gòu)，從而提高復(fù)雜RNA模板的擴增性能、提高反轉(zhuǎn)錄cDNA的長度和產(chǎn)量，從而提高后續(xù)檢測的靈敏度。合成的鏈cDNA可廣泛用于2nd Strand的合成、雜交、PCR擴增、Real-Time PCR反應(yīng)等。

特點：
1．dsDNase有效去除基因組的污染，抑制了因基因組污染引起的非特異性擴增。
2．55℃進行反轉(zhuǎn)錄的MLV反轉(zhuǎn)錄酶，能更好的轉(zhuǎn)錄含有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的RNA模板。
3．便捷的反轉(zhuǎn)錄預(yù)混體系。
4．反轉(zhuǎn)錄引物為Random Primer和Oligo dT Primer預(yù)混的RT Primer Mix，可更好的合成樣品中的各種cDNA。



產(chǎn)品組成：

組分	MT0015-100T	MT0015-2000T
5×RT MasterMix(with dsDNase)	400μl	8ml
20×Oligo dT(25)&Random Primer	100μl	2ml
Rnase-Free H2O	1ml×2	50ml

注：1．本試劑盒可有效反轉(zhuǎn)錄mRNA、tRNA、LncRNA、ncRNA。
  2．本試劑盒不可反轉(zhuǎn)錄microRNA、病毒DNA/RNA樣品。

保存條件：請置于-20℃，可保存2年；避免反復(fù)凍融。

使用方法：

1．按以下組分配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液

Total RNA or Poly(A) RNA	0.1-2μg
5×RT MasterMix(with dsDNase)	4μl
*20×Oligo dT(25)&Random Primer	1μl
Rnase-Free H2O	Up to 20μl

*注：反轉(zhuǎn)錄引物可根據(jù)需要改用特異性引物。
2．在PCR儀上按以下條件進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):
  37℃   10分鐘（去除gDNA）
  55℃   *30～60min（cDNA 合成）
  85℃   10分鐘（失活 MLV）
  4℃
*注：采用60min通?？梢垣@得更多的cDNA產(chǎn)物（100％產(chǎn)量），通常30分鐘也可以獲得足夠的cDNA產(chǎn)物（80％產(chǎn)量）。

根據(jù)您的關(guān)注的一步法cDNA鏈合成試劑盒，您可能還對以下產(chǎn)品有需求：

貨號	名稱	規(guī)格
ZN0006	ABCA1 mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0055	AMER1 mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0076	APEX1/Ref1 mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0089	ARG1 mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0097	ASM mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0115	BACH1 mRNA原位雜交試劑盒	100T

關(guān)注一步法cDNA鏈合成試劑盒，的同時，為您推薦更多您可能感興趣的產(chǎn)品：



名稱：CHRM1 mRNA原位雜交試劑盒
貨號：ZN0288
規(guī)格：100T
基本信息：
保存條件：4℃保存一年
工作量：100張切片。
有效期：一年。
適用種屬：human,rat,mouse,rabbit
標(biāo)記方式：3’—尾段標(biāo)記
試劑盒中內(nèi)容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.預(yù)雜交液 2ml；
3.CHRM1 mRNA原位雜交試劑盒寡核苷酸探針雜交液 2ml；
4.封閉液 5ml；
5.生物素化鼠抗dì高辛 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化過氧化物酶 5ml。
用戶自備試劑：
原位雜交專用蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液(3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位雜交用 PBS)
一．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片
準(zhǔn)備工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%檸檬酸——100ml蒸餾水中加檸檬酸(C6H8O7?H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3?2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸餾水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸餾水即可。
原位雜交用PBS(1000ml蒸餾水加氯化鈉30g,Na2HPO4?12H2O 6g,NaH2PO4?2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及時固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對mRNA的分解作用。此外，過度固定對原位雜交有明顯的不利影響。
1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．細(xì)胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養(yǎng)，條件為37℃和5%的CO2，所用培養(yǎng)基為Dulbecco基礎(chǔ)培養(yǎng)基。細(xì)胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。
3．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。
7．預(yù)雜交：濕盒的準(zhǔn)備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預(yù)雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時。吸取多余液體，不洗。
8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據(jù)雜交情況可以調(diào)節(jié))。
9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復(fù)0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。
10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗
11.滴加生物素化鼠抗dì高辛：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
13.滴加生物素化過氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。
14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標(biāo)本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。
15.必要時蘇木素復(fù)染，充分水洗。
16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。
二．石蠟切片
如果有條件的話，應(yīng)盡可能地采用新鮮標(biāo)本。標(biāo)本離體后，及時予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。標(biāo)本較大時用刀片切成厚度不超過4mm的小塊，固定1小時即可，較大的標(biāo)本固定不要超過2小時。某些組織對過度固定尤其敏感，如動物大腦，固定時間30-40分鐘，一般不要超過1小時。
1．常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。
3．石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化3--30分鐘(視標(biāo)本新舊、厚薄自行調(diào)整)。用戶可以比較不同的消化時間，例如5分鐘,10分鐘，20分鐘，30分鐘。以找到zuì佳的消化時間。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。其余步驟和冰凍切片6-16步相同。
結(jié)果觀察：
CHRM1的細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色。
注意事項：
由于特定的mRNA序列僅占總mRNA的少數(shù)，加上基因僅由四個堿基排列組合而成，因此原位雜交容易出現(xiàn)非特異性染色。通過不加探針和用陰性標(biāo)本做對照，基本可以確定染色是否為特異性的。有明顯的非特異性染色現(xiàn)象時，用預(yù)雜交液對含探針的雜交液進行稀釋，一般稀釋2—10倍；并應(yīng)加強探針雜交后的洗滌。如果有少量的細(xì)胞核著色屬于正常情況；如果出現(xiàn)大量的細(xì)胞核著色，往往和標(biāo)本固定時間過長有關(guān)，應(yīng)重新處理標(biāo)本。

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