零背景平末端克隆試劑盒是高品質(zhì)的克隆與表達產(chǎn)品，由北京百奧萊博供應(yīng)，本產(chǎn)品僅用于生物化學(xué)研究方面，本產(chǎn)品質(zhì)量好，且具價格，深為用戶稱道，了解更多零背景平末端克隆試劑盒等克隆與表達產(chǎn)品請聯(lián)系我司咨詢訂購。...

特別提示：包括零背景平末端克隆試劑盒(Kan抗性)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：零背景平末端克隆試劑盒(Kan抗性)
英文名稱：Blunt Cloning Kit(Resistance to Kanamycin)
產(chǎn)品貨號：BTN160684K
產(chǎn)品規(guī)格：25次

本產(chǎn)品是基于Topoisomerase能夠在幾秒鐘之內(nèi)高速連接DNA片段的原理開發(fā)的無背景克隆試劑盒，它使用了本公司通過定點突變改良的TOPO酶，連接效率比野生型更高。

產(chǎn)品特點：
1. 快速，連接反應(yīng)幾乎在幾秒鐘內(nèi)完成，連接率幾乎達到。
2. 適用于pfu、KOD等高保真聚合酶擴增的平末端片段的克隆。
3. 無雜帶或引物二聚體的PCR擴增產(chǎn)物可以不經(jīng)過純化直接用于連接反應(yīng)。
4. 零背景，無需IPTG-X-Gal藍白斑篩選，故不需要IPTG-X-Gal培養(yǎng)基。
5. 本試劑盒按10μl標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系。
6. 提供含Amp和Kan兩種抗性的載體供選擇（BTN160684A是含Amp抗性TOPO載體，BTN60684K是含Kan抗性TOPO載體）。

產(chǎn)品組成：

組分	編號	規(guī)格
TOPO-Kan Blunt載體	BTN160684K	25μl
連接緩沖液	BTN160684B	25μl
M13F引物		50uL
M13R引物		50uL
超純水	BTN100935	1mL

保存條件：-20℃，有效期一年。

自備試劑：DNA插入片段、感受態(tài)細胞、SOC或LB培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿（含抗菌素和不含的）

使用方法：
1. 如果是PCR制備插入片段，所用引物不能磷酸化，使用pfu、KOD等產(chǎn)生平末端片段的高保真DNA聚合酶。為保證擴增產(chǎn)物的完整性，PCR循環(huán)結(jié)束后，再延伸5-10分鐘，確保片段延伸完全。
2. 電泳檢測并相對定量PCR片段（跟DNA marker比較）。根據(jù)插入片段長度和下表確定每次連接反應(yīng)需要的zuì佳用量：

插入片段長度	zuì佳用量
100-1000bp	20-50ng
1000-2000bp	50-100ng
2000-5000bp	100-200ng

3. 在一個干凈的塑料離心管中，室溫下（不要放在冰上）設(shè)置如下連接反應(yīng)體系：

加入物	加入量
純化后的PCR產(chǎn)物	不超過8μl
TOPO-Kan Blunt載體	1uL
連接緩沖液	1uL
超純水	補到10uL

  注意：如果使用未經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物，則需要加入量不能超過1μl，否則PCR體系會干擾連接體系。
4. 輕柔吹打混勻后，短暫離心，常溫（20-30℃）放置0-5分鐘。如果在冬天室溫低于20℃，建議使用25℃水浴或金屬浴。
  注意：連接時間超過5分鐘的話連接效率會降低。
5. 如果當(dāng)天不轉(zhuǎn)化，可以將離心管放-20℃保存。如果轉(zhuǎn)化，則取5μl連接液加到50-100μl剛剛?cè)诨母惺軕B(tài)細胞中，輕柔混勻。
  注意：本產(chǎn)品要求感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率不得低于5×10E7cfu/ug。
6. 如果片段長度小于2 Kb，則不需要冰浴和熱激，直接在離心管中加入500μl不含抗菌素的SOC或LB培養(yǎng)基，然后取200μl涂盤。也可以先3000g離心2分鐘后，棄掉大部分上清，只留約100μl左右，然后重懸細菌后全部涂盤在含Kan的培養(yǎng)皿上，37℃過夜培養(yǎng)。
7. 如果片段長度長于2 Kb，則按常規(guī)轉(zhuǎn)化方式，先冰浴2-30分鐘，然后42℃熱激30秒，冰上防放置2分鐘，再在離心管中加入500μl不含抗菌素的SOC或LB培養(yǎng)基，37℃ 250rpm培養(yǎng)60分鐘，然后取200μl涂盤。也可以先3000g離心2分鐘后，棄掉大部分上清，只留約100μl左右，然后重懸細菌后全部涂盤在含Kan的培養(yǎng)皿上，37℃過夜培養(yǎng)。
8. 用M13F/M13R通用引物進行菌落PCR或直接測序來鑒定重組子。

該載體的多克隆位點序列：


通用測序引物序列：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：CAGGAAACAGCTATGACC

根據(jù)您的關(guān)注的零背景平末端克隆試劑盒(Kan抗性)，您可能還對以下產(chǎn)品有需求：

貨號	名稱	規(guī)格
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YT414	pression/YT414.html" target="_blank">10% SDS水溶液	100ml
YT475	pression/YT475.html" target="_blank">N端DsRed標(biāo)簽融合蛋白質(zhì)粒(紅色熒光蛋白)	1μg
YT481	pression/YT481.html" target="_blank">N端His標(biāo)簽融合蛋白質(zhì)粒	1μg

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