T3體外轉(zhuǎn)錄試劑盒由北京百奧萊博供貨并提供相關(guān)技術(shù)服務(wù)支持，本品用于科研試驗(yàn)，我公司專注于核酸擴(kuò)增(PCR)產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)和供應(yīng)，為您提供的T3體外轉(zhuǎn)錄試劑盒質(zhì)量可靠，批間差小，且價格公道，熱切盼望您選購我們的產(chǎn)品。...

特別提示：包括T3體外轉(zhuǎn)錄試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：T3體外轉(zhuǎn)錄試劑盒
英文名稱：T3 in vitro Transcription Kit
產(chǎn)品貨號：BTN91108
產(chǎn)品規(guī)格：50次

本試劑盒是基于沙門氏噬菌體T3 RNA聚合酶的RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，它利用含有T3啟動子的模版DNA，以NTP為底物，從T3啟動子下游開始合成與模板DNA中一條鏈互補(bǔ)的RNA，簡單快速獲得大量的RNA分子。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需提供含T3啟動子的DNA模板即可以進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，不需耍單獨(dú)準(zhǔn)備每一個成份。
2. 單溶液預(yù)配液，減少加樣次數(shù)，避免了操作誤差，增加了可重復(fù)性。
3. 模板DNA可以是線性化的質(zhì)粒DNA，也可以是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
4.可以合成的RNA的zuì佳長度在20nt到5000nt之問。
5.產(chǎn)品配方經(jīng)過精心優(yōu)化，每μg DNA模板可以合成2-6μg RNA。
6. 得到的RNA可以用于RNA結(jié)構(gòu)研究、核解生物化學(xué)、體外翻譯、RNA-蛋白質(zhì)相互作用、反義技術(shù)、SELEX技術(shù)和RNA干擾(RNAi)等實(shí)驗(yàn)。

試劑盒組成：

成分	規(guī)格
轉(zhuǎn)錄預(yù)配液(2×)	0.5mL
陽性對照DNA(1.3 Kb片段)	20μL(10ng/μL)
T3 RNA聚合酶混合液	50μL
RNase-free水	1mL
說明書	1份

儲存條件：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、制備DNA模板
PCR片段和質(zhì)粒DNA都可以用作體外轉(zhuǎn)錄的模板，但是必須注意以下幾點(diǎn)：
1)必須使用線性化的DNA。如果是質(zhì)粒DNA，則必須先用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切成線狀。
2)是需要轉(zhuǎn)錄的DNA序列的上游必須有T3啟動子。如果模板是PCR產(chǎn)物，則可以在設(shè)計引物時將T3啟動子序列(5′AATTAACCCTCACTAAAGG 3′)加上。如果是將DNA片段克隆到載體上，則需要選擇有T3啟動子的載體，并且克隆位點(diǎn)必須位于T3啟動子下游。
3)是需要轉(zhuǎn)錄的DNA序列的下游端zuì好不要是3′突出。如果是3′突出(如選擇了Pst I來線性化質(zhì)粒)，則zuì好用T4 DNA聚合酶修平。
4)是必須保證DNA模板中沒有RNase。由于提取質(zhì)粒DNA的過程中一般要使用大量的RNase A，因此質(zhì)粒DNA一般都有嚴(yán)重的RNase A污染，所以在用作模板前，zuì好采取膠回收得方法回收質(zhì)粒DNA。并且加入少量總RNA一起保溫，然后電泳檢測RNA是否被降解，以此判斷純化的DNA模板是否有殘留RNase A。

二、體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
1.在一個RNase-free的塑料離心管中，在室溫下(不是在4℃下)按次序加入下列成分：

成分	加入量	備注
DNA模板	xμl	總量在50 ng-1μg(如果模板是PCR片段，建議用50ng左右；如果模板是質(zhì)粒DNA，建議用1μg左右；如果用本產(chǎn)品提供的陽性對照，建議用4μL)
轉(zhuǎn)錄預(yù)配液，2×	10μl	需室溫時使用
T3 RNA聚合酶混合液	1μl	本成分還含其他促進(jìn)劑，所以是混合物
RNase-free水	補(bǔ)水到20μL

注：此為20μL反應(yīng)體系的用量，對其他體積的反應(yīng)體系，各成分的用量可以按比例增減。如果需要標(biāo)記RNA探針，則需要定做NTP分開而不是NTP預(yù)先混合的試劑盒。如果需要得到加帽RNA，則需要加入自備的加帽修飾核苷酸(本公司有各種加帽修飾核苷酸)。
2. 37℃保溫1-2小時。注意：延長保溫時間并不能提高產(chǎn)量。
3. 70℃加熱10分鐘滅活T3 RNA聚合酶。
4. 取1-3μL電泳檢測轉(zhuǎn)錄效果。一般1μg DNA可以合成 5-10μg的RNA。
5. 得到的RNA可以放-80℃保存。

若需進(jìn)一步去除DNA模板，可參考下列操作步驟，但所用試劑需另行購買，本試劑盒不提供。
1.在體外轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入3-5U自備的RNase-free DNase(BTN90903；3-5U/μL)。
2. 37℃保溫15-30分鐘。
3. 補(bǔ)水到100μL，
4. 用自備的等體積(100μL)的Tris飽和酚-lǜ仿抽提一次去除殘留的DNase和RNA聚合酶。
5.在上清中加200μL自備的微量核酸沉淀劑(BTN50903；用前需要搖晃混勻)，振蕩后15000rpm離心3～5分鐘，棄上清。
6. 加入1mL 75%乙醇，震蕩10秒后15000rpm離心3～5分鐘，棄上清。
7. 短暫離心數(shù)秒，用槍頭吸棄上清。
8. 晾干半分鐘，所得沉淀即去除DNA模板后的RNA?？扇苡赗Nase-free水中后立即使用或放-80℃長期保存。

疑難解答：
1、沒有RNA產(chǎn)物。zuì常見原因是DNA模板有RNase污染，測試方法是用純化的RNA跟模板DNA一起保溫，再檢測RNA是否降解。本試劑盒緩沖液和酶混合液中有RNase inhibitor，如果模板RNase污染嚴(yán)重，可能需要用戶補(bǔ)加RNase inhibitor。
2、RNA產(chǎn)量低。zuì常見的原因是DNA模板序列。在轉(zhuǎn)錄序列的個和第二個堿基zuì好都是G，在前14個堿基內(nèi)避免有U存在。
3、RNA長度比預(yù)期的短?？赡苁悄０逍蛄兄杏蠺3 RNA聚合酶的終止序列?？梢愿挠肧P6或T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(啟動子也必須改成SP6或T7啟動子)。
4、RNA長度比預(yù)計的長。T3 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一樣，有不依賴于模板的加尾功能，zuì多有一半的RNA可以帶一個或兩個堿基的尾巴。如果RNA長度比預(yù)計的長很多，使用的模板又是質(zhì)粒DNA，則可能是質(zhì)粒DNA線性化不徹底。
5、5′單磷酸還是三磷酸。如果使用GTP，則得到的RNA是三磷酸，體外轉(zhuǎn)錄時如果保溫時間太長(如12小時)，則有50%的三磷酸會變成單磷酸。如果在轉(zhuǎn)錄體系中加入GMP，則T3 RNA聚合酶將優(yōu)先使用GMP，所得RNA產(chǎn)物中5′端是單磷酸的比例將大大增加。

根據(jù)您的關(guān)注的T3體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，您可能還對以下產(chǎn)品有需求：



名稱：25mM氯化鎂溶液(PCR級MgCl2溶液)
貨號：BTN90302
規(guī)格：5mL
本產(chǎn)品為專門用于PCR的MgCl2，其濃度為25mM，可以用于調(diào)節(jié)MgCl2的zuì佳濃度。

儲存條件：低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。

名稱：miRNA熒光定量RT-PCR檢測試劑盒
貨號：BTN131042
規(guī)格：25次
本試劑盒采用SYBR Green I 嵌合熒光染料法的原理來進(jìn)行miRNA熒光定量PCR檢測。本產(chǎn)品是專門為miRNA定量檢測而研發(fā)的新一代預(yù)混形式的熒光定量PCR檢測試劑。2×miRNA qPCR Mix包含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液、PCR增強(qiáng)劑等所有PCR所需要的成分。miRNA qPCR Mix中所含的熒光染料SYBR Green I可以與所有的雙鏈DNA結(jié)合，使該產(chǎn)品可用于不同靶序列的檢測而不需合成特異性標(biāo)記探針。其中的Taq DNA polymerase是經(jīng)化學(xué)修飾的熱啟動酶，配合獨(dú)特的緩沖體系，使反應(yīng)特異性更好，靈敏度更高，并能在更廣的范圍內(nèi)對miRNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
1. 簡便、快捷完成miRNA的檢測。
2. 檢測通量高，只需zuì少的RNA樣本，即可同時進(jìn)行多種目標(biāo)miRNA的檢測。
3. 檢測特異性好，獨(dú)特的miRNA引物設(shè)計技術(shù)及其優(yōu)化的反應(yīng)體系避免了非特異性擴(kuò)增、特別是Pre-miRNA的污染。
4. 檢測分辨率高：該系統(tǒng)能分辨單堿基差異的miRNA。
5. 檢測靈敏度高：可在低至pg級的總RNA中檢測到特異表達(dá)的miRNA。

試劑盒組成：

成分	規(guī)格
2×miRNA qPCR Mix	0.75ml
Reverse Primer(10μm)	30μl
RNase-Free Water	1ml
miRNA cDNA鏈合成試劑盒	25T
說明書	1份

儲存條件：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、miRNA cDNA鏈合成
請參見miRNA cDNA 鏈合成試劑盒產(chǎn)品使用說明書。

二、miRNA熒光定量檢測
1.室溫融化2×miRNA qPCR Mix和Reverse primer(10μm)。
2. 使用時請將2×miRNA qPCR Mix上下顛倒輕輕均勻混合，避免起泡，并經(jīng)短暫離心后使用。如果試劑沒有混勻，其反應(yīng)性能會有所下降。
3. 按照下表組分配制熒光定量PCR反應(yīng)體系：

試劑組份	體積
2×miRNA qPCR Mix	25μl
Forward Primer(自備)	1μl
Reverse Primer	1μl
miRNA 鏈cDNA	xμl
RNase-Free Water	至50μl

4. 建議反應(yīng)程序設(shè)置如下：

循環(huán)	溫度	時間
1×	95℃	10min
40～45×	95℃	15s
	60℃	1min
溶解曲線分析	根據(jù)PCR儀要求設(shè)定

注意事項(xiàng)：
1. miRNA 鏈cDNA的加入量不要超過Real time PCR 體積10%。
2. 對于特殊的檢測體系，高含量的cDNA 模板易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，根據(jù)所檢測miRNA的豐度適當(dāng)?shù)南♂宑DNA(稀釋10倍或者100倍)。
3. 2×miRNA qPCR Mix中含有SYBR Green I和ROX染料，保存本產(chǎn)品或配制PCR反應(yīng)液時應(yīng)避免強(qiáng)光照射。

關(guān)注T3體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，的同時，為您推薦更多您可能感興趣的產(chǎn)品：

貨號	名稱	規(guī)格
BTN70902	5M甜菜堿溶液，PCR級	1.5mL
BTN131083	Ribo-SPIA cDNA擴(kuò)增試劑盒	20次
YT381	PCR試劑盒(含YT Taq酶，Buffer，dNTP，上樣液)	400次
YT384	PCR Master Mix (含桔色電泳染料)	400次|2000次10000次
YT390	dNTP混合溶液(2.5mM)	1ml
WE0118	結(jié)核分枝桿菌基因分型試劑盒(VNTR-9)	50次

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