熱啟動(dòng)高保真酶的品牌是百奧萊博，是優(yōu)質(zhì)的核酸擴(kuò)增(PCR)產(chǎn)品，本制品用于科研試驗(yàn)，我公司專注于核酸擴(kuò)增(PCR)產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)和供應(yīng)，為您提供的熱啟動(dòng)高保真酶質(zhì)量可靠，批間差小，且價(jià)格公道，熱切盼望您選購(gòu)我們的產(chǎn)品。...

特別提示：包括熱啟動(dòng)高保真酶在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：熱啟動(dòng)高保真酶
英文名稱：HotStart Pfu DNA Polymerase
產(chǎn)品貨號(hào)：SY0038
產(chǎn)品規(guī)格：100U

HotStart Pfu DNA Polymerase在Pfu DNA Polymerase的基礎(chǔ)上添加了在常溫下能夠抑制5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性的兩種單克隆抗體，可進(jìn)行高特異性的熱啟動(dòng)(Hot Start)PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物為平端。Pfu DNA Polymerase是經(jīng)過(guò)基因工程改造的，新一代超保真DNA聚合酶，具有高的擴(kuò)增效率和廣泛的模板適應(yīng)性，可用于幾乎所有PCR反應(yīng)。其行進(jìn)性 (processivity)得到了大幅度提升，即使是非常復(fù)雜的模板，也能準(zhǔn)確快速的完成反應(yīng)。其錯(cuò)配率是普通Taq酶的1/52，是Pfu酶的1/6；且擴(kuò)增速度可以達(dá)到15秒/kb。

本產(chǎn)品中附帶的5×HS Pfu buffer對(duì)于簡(jiǎn)單或復(fù)雜模板、短片段或長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增都具有良好的適應(yīng)性。緩沖液中已經(jīng)含有10 mM Mg2+ (1×終濃度為2 mM)，可以使用產(chǎn)品中提供的DMSO/MgSO4對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。另外，產(chǎn)品中附帶的PCR Enhancer可有助于高GC含量片段的擴(kuò)增。

產(chǎn)品組份：
5×HS Pfu buffer(with 10 mM MgSO4)：1.25 ml
25 mM MgSO4：1 ml
dNTP Mix(10 mM each)：100 μl
HS Pfu DNA Polymerase(1 U/μl)：100 μl
5×PCR Enhancer：500 μl
DMSO：100 μl
10×Loading buffer：1.25 ml

活性定義：用活性化的大馬哈魚精子DNA作為模板/引物，74℃ 30分鐘內(nèi)，攝入10 nmol的全核苷酸為酸性不溶物的活性定義為1個(gè)活性單位（U）。
儲(chǔ)存條件：-20℃

質(zhì)量控制：
核酸外切酶殘留檢測(cè)：10 U本品和0.6 μg λ-HindⅢ在74 oC下孵育1小時(shí)，DNA的電泳譜帶不發(fā)生變化。
核酸內(nèi)切酶殘留檢測(cè)：10 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在74 oC下孵育1小時(shí)，DNA的電泳譜帶不發(fā)生變化。
大腸桿菌殘留DNA檢測(cè): 50 μl體系中，加入2U本品，以ddH2O為模板，擴(kuò)增E.coil 16s rDNA基因。35個(gè)循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，無(wú)擴(kuò)增條帶。
功能檢測(cè)1：50 μl PCR體系中加入1U本品，以100 ng人基因組DNA為模板擴(kuò)增α-1-antitrypsin基因。30個(gè)循環(huán)后取10% PCR產(chǎn)物進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，觀察到單一的8.2 kb條帶。
功能檢測(cè)2：50 μl PCR體系中加入1U本品，以10 ng λDNA為模板擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，取10% PCR產(chǎn)物進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，觀察到單一的15 kb條帶。

使用方法：
1. 所有操作請(qǐng)?jiān)诒线M(jìn)行，各組分解凍后請(qǐng)充分搖勻。為了防止HS Pfu DNA Polymerase的校對(duì)活性降解引物，請(qǐng)將聚合酶zuì后加入反應(yīng)體系中。各組分使用完畢后及時(shí)放回-20℃。5×HS Pfu buffer請(qǐng)勿長(zhǎng)時(shí)間敞口放置。

ddH2O	to 50 μl
d5×HS Pfu buffer (with 10 mM MgSO4)	10 μl
d25 mM MgSO4a	optional
ddNTP Mix(10 mM each)b	1 μl
dDMSOc	optional
d5×PCR Enhancerd	optional
d模板DNAe	optional
dForward Primer(10 μM)	2μl
dReverse Primer(10 μM)	2 μl
HS Pfu DNA Polymerase(1 U/μl)f	1 μl

【注】：
a. 對(duì)于大多數(shù)PCR反應(yīng)，Mg2+zuì佳終濃度為1.5-2 mM。體系中已含有終濃度為2 mM Mg2+，如有需要，可用25 mM MgSO4，以0.2-0.5 mM為間隔向上摸索Mg2+zuì佳使用濃度。
b. 請(qǐng)勿使用dUTP和帶有尿嘧啶的引物或模板。
c. 擴(kuò)增子GC含量>60%時(shí)加入終濃度3%的DMSO有可能會(huì)有助于擴(kuò)增。
d. 推薦僅當(dāng)擴(kuò)增子GC含量>60%且優(yōu)化條件也無(wú)法正常擴(kuò)增時(shí)使用；可能會(huì)降低保真度。
e. 不同模板zuì佳反應(yīng)濃度有所不同，下表為50 μl反應(yīng)體系推薦模板使用量：

模板種類/擴(kuò)增長(zhǎng)度	＜1 kb	1 kb～10 kb	＞10 kb
基因組DNA	50 ng～250 ng	100 ng～300 ng	150 ng～400 ng
質(zhì)粒或病毒DNA	10 pg～20 ng	10 pg～20 ng	1 ng～30 ng
cDNA	1～5 μl(不超過(guò)PCR反應(yīng)總體積的1/10)

f. 推薦的酶的終濃度為1U/50 μl反應(yīng)。然而，根據(jù)擴(kuò)增子的長(zhǎng)度和復(fù)雜程度不同，可將HS Pfu DNA Polymerase在0.5-2U/50 μl反應(yīng)之間進(jìn)行優(yōu)化。但請(qǐng)勿超過(guò)2U/50 μl，尤其當(dāng)擴(kuò)增子長(zhǎng)度大于5 kb時(shí)。HS Pfu DNA Polymerase具有較強(qiáng)的校對(duì)活性。如擴(kuò)增產(chǎn)物需要進(jìn)行TA克隆，加A之前必須進(jìn)行DNA純化。

2. 推薦PCR反應(yīng)條件：

循環(huán)步驟	溫度	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性a	95℃	30 sec～3 min	1
變性b	95℃	5～10 sec	25～35循環(huán)
退火c	45℃～72℃	10～30 sec
延伸d	72℃	15～30 sec/kb
徹底延伸	72℃	5～10 min	1

【注】：
a. 推薦大多數(shù)模板的預(yù)變性溫度為95℃，時(shí)間為：質(zhì)?；虿《綝NA，30 sec，基因組2 min，cDNA 3 min；對(duì)于高GC含量模板，預(yù)變性溫度需提升至98℃，變性時(shí)間為2～4 min；對(duì)于超過(guò)10 kb的擴(kuò)增子，預(yù)變性溫度需降低至92℃，變性時(shí)間不超過(guò)2 min。
b. 對(duì)于大多數(shù)模板在95℃變性時(shí)間設(shè)為5～10 sec即可。對(duì)于高GC含量模板，變性溫度需提升至98℃；對(duì)于超過(guò)10 kb的擴(kuò)增子，變性溫度需降低至92℃，并延長(zhǎng)變性時(shí)間至15 sec。
c. HS Pfu DNA Polymerase能夠促進(jìn)模板和引物退火。一般來(lái)說(shuō)，退火溫度設(shè)置為引物Tm值±3℃范圍內(nèi)之間即可。如果需要，可以建立一個(gè)溫度梯度反應(yīng)去尋找引物模板結(jié)合的zuì適溫度。退火時(shí)間太長(zhǎng)可能導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物在膠上呈現(xiàn)彌散狀。因此，推薦退火時(shí)間設(shè)置為10 sec即可。對(duì)于一些困難模板，退火時(shí)間可在10～30sec之間調(diào)整。
d. 對(duì)于大多數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)，延伸過(guò)程可在72℃進(jìn)行。對(duì)于超過(guò)10 kb的擴(kuò)增片段，需降低延伸溫度至68℃。延伸時(shí)間取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度和模板的復(fù)雜性。使用質(zhì)粒等復(fù)雜程度較低的DNA做模板時(shí)，可使用15 sec/kb的延伸時(shí)間；使用基因組
cDNA等復(fù)雜程度較高的DNA做模板時(shí)，延伸時(shí)間應(yīng)為30 sec/kb。太長(zhǎng)的延伸時(shí)間會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加，因此延伸時(shí)間請(qǐng)勿超過(guò)30 sec/kb。

3. 長(zhǎng)片段PCR指南：
*使用高質(zhì)量的模板；
*使用長(zhǎng)引物。將引物加長(zhǎng)至Tm值68～72℃，把退火/延伸溫度合并為68℃。這樣可以顯著提高擴(kuò)增特異性；
*適當(dāng)提高酶量，但50μl反應(yīng)體系內(nèi)不要超過(guò)2 U；
*添加DMSO，以1%的濃度遞增。調(diào)整范圍為0%～6%；
*推薦反應(yīng)條件設(shè)置：

循環(huán)步驟	溫度	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性	92℃	2 min	1
變性	92℃	5～10 sec	25～35循環(huán)
延伸	68℃	15～30 sec/kb
徹底延伸	68℃	5～10 min	1

4. 高GC含量模板PCR指南：
*使用高質(zhì)量的模板；
*提高變性溫度至98℃；
*添加DMSO，以1%的濃度遞增。調(diào)整范圍為0%～8%；
*添加5×PCR Enhancer；
*推薦反應(yīng)條件設(shè)置：

循環(huán)步驟	溫度	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性	98℃	3 min	1
變性	98℃	10 sec	25～35循環(huán)
退火	45℃～72℃	10～30sec
延伸	72℃	15～30 sec/kb
徹底延伸	72℃	5～10 min	1

引物設(shè)計(jì)注意事項(xiàng):
1）引物3’端zuì后一個(gè)堿基zuì好為G或者C；
2）引物3’端zuì后8個(gè)堿基應(yīng)避免出現(xiàn)連續(xù)錯(cuò)配；
3）引物3’端盡量避免發(fā)夾結(jié)構(gòu)出現(xiàn)；
4）引物的Tm值調(diào)整至55℃-65℃之間。
5）引物額外附加序列，即與模板非配對(duì)序列，不應(yīng)參與引物Tm值計(jì)算；
6）引物的GC含量控制在40%-60%之間；
7）正向引物和反向引物Tm值以及GC含量盡可能一致。

根據(jù)您的關(guān)注的熱啟動(dòng)高保真酶，您可能還對(duì)以下產(chǎn)品有需求：



名稱：PCR Mix染料
貨號(hào)：BTN131212
規(guī)格：10mL
本產(chǎn)品可加入到PCR反應(yīng)液中，使PCR產(chǎn)物可直接上樣電泳，其分子量相當(dāng)于50bp大小的DNA片段，不干擾觀察。
注：本產(chǎn)品不是PCR熒光染料，是一類可見(jiàn)光染料(類似電泳用的溴酚藍(lán)，二甲苯藍(lán)等指示劑)

儲(chǔ)存條件：低溫運(yùn)輸和-20℃保存、有效期一年。

名稱：可逆型Taq DNA聚合酶抑制劑
貨號(hào)：BTN60901
規(guī)格：0.3mL
Taq DNA聚合酶是進(jìn)行PCR的zuì常用工具酶，但是由于它在常溫下還是具有部分活性，所以經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)非特異的擴(kuò)增產(chǎn)物，尤其是當(dāng)PCR反應(yīng)體系中有大量非特異DNA存在的時(shí)候。目前zuì常見(jiàn)的解決方法是使用抗Taq DNA聚合酶的抗體和使用經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶(如AmpliTaq Gold)，但前者的缺點(diǎn)是加熱后抗體會(huì)不可逆失活，后者的缺點(diǎn)是需要預(yù)熱處理使酶激活。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.可逆抑制Taq DNA聚合酶的活性，即常溫抑制Taq酶活性，在45℃以上抑制功能喪失，當(dāng)溫度降低到45℃以下后，抑制活性又得以恢復(fù)。
2. 耐熱，產(chǎn)品本身為非蛋白質(zhì)試劑，遠(yuǎn)比Anti-Taq抗體穩(wěn)定，便于保存和運(yùn)輸。
3. 使用簡(jiǎn)單，在加Taq酶前將本產(chǎn)品按PCR反應(yīng)體積的1/10直接加入即可。
4.適用范圍廣，除Taq DNA聚合酶外，還可用于抑制其他DNA聚合酶的活性，如：Tth pol、Stoffel片段、Tfl pol、Tbr pol等。而一種酶的抗體一般對(duì)另一種酶的活性沒(méi)有抑制作用。
5.與后續(xù)的RT-PCR兼容。

儲(chǔ)存條件：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：
在加入Taq或Tth DNA聚合酶之前，按PCR反應(yīng)終體積1/10的比例將本產(chǎn)品加入到反應(yīng)體系中混勻，然后再加入DNA聚合酶，啟動(dòng)PCR反應(yīng)。

名稱：cDNA鏈合成試劑盒(RNase H-)
貨號(hào)：YT395
規(guī)格：10次
本品是一種采用了經(jīng)過(guò)改造和優(yōu)化的M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)，用于在總RNA、mRNA等RNA模板的基礎(chǔ)上反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA鏈的試劑盒。本試劑盒包含了進(jìn)行cDNA鏈合成所需的各種試劑。

采用本試劑盒可以合成長(zhǎng)達(dá)13kb的cDNA鏈。在采用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)的情況下，由于缺失了RNase H，RNA和DNA雙鏈復(fù)合物中的RNA不會(huì)被降解，這樣反轉(zhuǎn)錄出來(lái)的cDNA的長(zhǎng)度就會(huì)更長(zhǎng)，并且產(chǎn)量更高。

試劑盒中提供了RNase Inhibitor，確保在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的RNA不會(huì)被RNA酶所降解并取得較好的反轉(zhuǎn)錄效果。

試劑盒還提供了Oligo(dT)18和random hexamer這兩種引物，前者適合用于帶有Poly(A)尾的mRNA的反轉(zhuǎn)錄，后者進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí)不需要poly(A)尾。也可以自行采用基因特異性引物進(jìn)行cDNA鏈的合成。

試劑盒中提供的Control Primer為17聚，即引物的長(zhǎng)度為17個(gè)堿基。試劑盒中提供的Control RNA為帶有3’poly(A)的1.1kb RNA。

使用本試劑盒合成的鏈，可以直接用于后續(xù)的常規(guī)PCR、real-time PCR、cDNA第二條鏈的合成等。

本試劑盒用于體積為20微升的cDNA鏈合成反應(yīng)時(shí)足夠進(jìn)行10個(gè)cDNA鏈樣品的合成。

產(chǎn)品組份：
M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)(200U/μl)————2000U
Reaction Buffer(5X)———————————50μl
RNase Inhibitor(20U/μl)————————10μl
dNTP Mix(10 mM each)——————————20μl
Oligo(dT)18 Primer(0.5μg/μl)—————10μl
Random Hexamer Primer(0.2μgμl)————10μl
Control RNA(20ng/>μl)—————————6μl
Control Primer(5pmol/μl)————————6μl
DEPC-treated Water———————————0.2ml

儲(chǔ)存條件：-20℃。

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