我公司致力于為客戶提供高純度、低成本的活性重組蛋白，包括Pfu DNA聚合酶在內(nèi)的各類受體、細胞因子、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、激素、酶、毒性蛋白、病毒抗原等。...

特別提示：包括Pfu DNA聚合酶在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：Pfu DNA聚合酶
英文名稱：Pfu DNA Polymerase
產(chǎn)品貨號：JN0016
產(chǎn)品規(guī)格：250U|250U×5

  本酶為Pyrococcus furiosus中分離的pfu DNA pol基因在大腸桿菌中進行表達后經(jīng)多步純化分離而得。Pfu DNA聚合酶具有3′→5′外 切酶(校正)活性，當聚合反應發(fā)生堿基錯配時，聚合酶的校正活性可將錯配的堿基切除。Pfu DNA聚合酶為使用范圍zuì廣的高保真DNA聚合酶，其錯誤率僅為1.3x10-6，推薦Pfu DNA聚合酶用于需高保真的PCR反應。

產(chǎn)品組成：

組份	JN0016-250U
Pfu DNA 聚合酶（5U/μl）	50μl
dNTP混合液(各10mM)	200μl
10×Pfu DNA Buffer with Mg2+	2ml

產(chǎn)品用途：用于要求保真度比較高的PCR反應，包括克隆PCR、DNA片段拼接、引入 突變、全基因合成，DNA片段的補平等（參見實驗方案）。

使用建議：
Pfu DNA聚合酶產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物為平滑末端，無3′端"A"突出，其PCR產(chǎn) 物的克隆有幾種方案。
1、PCR前引物進行5′端加磷修飾或?qū)CR產(chǎn)物磷酸化處理后再直接克隆 于平滑末端的載體中（參見實驗方案）。
2、將產(chǎn)物3′末端加A后再與T載體連接（參見實驗方案）。
3、引物中引入15bp與載體同源序列，利用BalbRec PCR產(chǎn)物一步定向無縫克隆試劑盒（Cat# JN0001）直接連接到目的載體。
由于Pfu DNA聚合酶的校對活性可引起引物從3′端被部分降解。因此在設計引物時應適當增加引物的長度，理想的引物長度為20-30堿基。另外為了減少由3′→5′外切酶活性引起的引物降解，盡量在冰上配制反應體系，并zuì后加入Pfu酶。

應用實例：


圖例一）50μl擴增體系中，以5ngλDNA為模板，對500bp～6.0kb片段的擴增結(jié)果。
泳道1：0.5kb； 泳道2：1.0kb； 泳道3：2.0kb；泳道4：3.0kb； 泳道5：4.0kb； 泳道6：6.0kb 泳道M：1kb DNA Marker；

圖例二） 50μl擴增體系中，分別以50ng～0.05ng人基因組DNA為模板，可對特定基因片段（380bp）進行很好的擴增。
泳道1：50ng；泳道2：5ng；泳道3：0.5ng；泳道4：0.05ng；泳道M：DNA 2000 Ladder

常用反應體系（50μl）

10×Pfu Buffer	5μl
上游引物	0.2-1.0μM(終濃度)
下游引物	0.2-1.0μM(終濃度)
dNTP(各10mM)	1.0μl
模板	1-50ng（質(zhì)粒）
	10ng-1μg(基因組)
Pfu	0.25μl（1.25U）
ddH2O	至50μl
*Mg2+終濃度為1.5mM

常用PCR循環(huán)：

當擴增片段<3K：

溫度	時間	循環(huán)數(shù)
94℃	1分鐘30秒
94℃	30秒	30次循環(huán)
57℃	30秒
72℃	根據(jù)產(chǎn)物長度調(diào)整，60秒/kb
72℃	5分鐘
4℃	保溫

當擴增片段≥3K（推薦引物長度≥30bp）：

溫度	時間	循環(huán)數(shù)
94℃	20秒
94℃	5秒	30次循環(huán)
68℃	根據(jù)產(chǎn)物長度調(diào)整，60秒/kb
72℃	5分鐘
4℃	保溫

質(zhì)量保證：經(jīng)多次柱純化，SDS-PAGE檢測純度大于95%；PCR 方法檢測無大腸桿菌DNA殘留，無核酸內(nèi)、外切酶污染。

活性定義：在74℃條件下，30分鐘內(nèi)催化10nmol dNTP的摻入反應成為酸不溶性物質(zhì)所需的酶量為一個單位。


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